研究对象：能在体外增殖并具有胚胎细胞全能性或多能性，通过适当条件可被诱导分化为各种类型分化细胞的试验模型。
胚胎性癌细胞（EC细胞）：因具有恶性肿瘤特性，并难以参与嵌合体胚胎的发育。
胚胎干细胞（ES细胞）：基本满足了研究哺乳动物发育和遗传及细胞分化的模型需要。
胚胎生殖细胞（EG细胞）：干细胞之母。除用以研究诱导细胞分化模型外，还为研究生殖细胞发育、分化和成熟调节机制、生殖系肿瘤发生提供材料。
3.Western Blot检测
全长检测
剪切体检测
第二节 抗凋亡研究
1．Bcl-2家族
（B cell lymphoma/leukemia-2）B细胞淋巴瘤/白血病-2)Bc1-2是一种原癌基因，是ced-9在哺乳类中的同源物。和一般的癌基因不同，Bc1-2延长细胞的生存，能抑制细胞凋亡,而不是促进细胞的增殖 。
一、端粒长度的测定
二、错配修复基因的测定
三、微卫星不稳定性的测定
新进展
细胞培养与抗衰老研究
大连医科大学药学院《组织和细胞培养技术》
理论授课教案
教学主题
第十章细胞培养在细胞分化研究中的应用4课时
教学对象
药学
授课时间
学年；年月日
教学目标
与要求
（含：怎样促使知识的融合、能力发展和素质的提高）
1.掌握细胞分化的基本概念、特征、调控及分子机制。
DNA ladders的观察
（一）超速离心
用氯化铯（CsCI）连续梯度超速离心＋EB染色（ethidium bromide，溴化乙锭）→45000转/min 16-24小时→条状粉红染色条带。
（二）琼脂糖凝胶电泳法
将凋亡细胞的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳，可以发现其DNA片段呈间隔180—200bp的阶梯状电泳条带，而未凋亡的DNA无降解，电泳条带表现为一大分子片段。
引言
人的发育过程：由受精卵发育成为一个成熟个体的过程实际上就是一个细胞由全能性向专能稳定性发展的过程。
第一节细胞分化概念
一、细胞分化特征
细胞分化（cell differentiation）概念：在个体发育过程中，子代细胞产生形态、结构和功能差异的过程。
细胞分化特征：
1.形态结构差异细胞形态与存在部位和功能相适应。时间上的分化；空间上的分化。
四、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）
五、流式细胞仪分析（FACS）
六、线粒体膜势能的检测(JC-1)
七、DNA含量分析
八、细胞凋亡的分子水平检测方法
Caspase分子的检测
凋亡相关分子的检测
促凋亡分子
抑凋亡分子
相关信号通路分子的检测
Caspase检测方法
1.分光光度法检测
2.FACS检测
2.染色质浓缩
3.边集现象
4.凋亡小体
（二）荧光显微镜观察
1.活细胞的Ho蓝色荧光最强
2.凋亡早期：Ho蓝色荧光较弱，有较弱的PI红色荧光
原因：DNA降解和丢失
凋亡晚期：PI红色荧光加强
3.坏死细胞PI红色荧光最强，蓝色荧光较弱
注意事项:
1.阴性对照：用不加染料的正常培养细胞
2.在PI染色时不能先固定细胞，否则不能将凋亡细胞、坏死细胞以及机械损伤细胞严格区分
教学方法
多媒体课件＋板书
教
学
内
容
大体内容与时间安排，研究
40分钟
3.细胞衰老的研究
60分钟
第11章细胞培养在细胞衰老、凋亡研究中的应用
细胞凋亡（apoptosis）：由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程。
细胞凋亡的意义：
1、确保正常发育、生长
有控降解
一般需要
有
不引起炎症反应
生理死亡方式
强烈刺激
成群细胞死亡
早期即丧失
增大肿胀
稀疏成网状
肿张破坏
破坏外溢
破裂成碎片
随机降解
不需要
无
引起炎症反应
病理死亡方式
二、细胞凋亡的生物化学检测方法
1.磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）
2.线粒体膜势能的检测
JC-1
3.DNA片断化检测
DNA Ladder测定
二、ES、EG细胞培养和建系的基本技术
1.饲养层细胞：提供培养细胞在体外生存、增殖必须物（生长因子等）。自身不分裂但保持代谢活性。
MEF细胞：取材容易，价廉，分泌效果好。
STO细胞：作饲养细胞培养效果优于MEF。
终止饲养层细胞分裂：10mg/L丝裂霉素C，37℃，4h，饲养层细胞在ES/EG建系初期是成败的关键。
细胞凋亡的信号转导通路
死亡受体信号通路
线粒体信号通路
内质网信号通路
综合解决方案
凋亡或坏死？
Annexin V
Tunel
死亡受体通路或线粒体通路？
Caspase 3, 8, 9
JC-1 stain
具体的调控分子机制
Bax/Bcl-2
Cytochrome C
JNK pathway
第二节 抗凋亡研究
抗衰老的常用研究方法：
4．分化细胞保持相应表型——稳定，不可逆
5.去分化与转分化如：蝾螈肢体再生
去分化：分化细胞回到未分化状态（脱分化)
转分化：去分化细胞再分化成另一种细胞
6.细胞生理状态随分化程度而显示差异：
高度分化细胞大多不再分裂，对环境因素的反应降低（不敏感）
二、细胞分化的调控
按序表达、选择性表达
（一）影响细胞分化的作用方式胚胎期最为重要
（1）研究某些前体细胞起源和细胞谱系演变较理想实验体系。
（2）定性、定量分析不同因素对生长和分化的影响；排除体内多因素相互作用。
2.分化抑制因子：成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子等。
抑制胚胎干细胞分化等。有待进一步研究。
三、细胞分化的分子机制
1.基因选择性表达与关闭；特定基因活化
2.基因时相性表达与关闭；
3.基因转录水平调控。例：血红蛋白形成。
四、细胞分化的调控障碍与疾病
（一）畸胎瘤
（二）恶性肿瘤
第二节正常细胞的分化研究
一、正常细胞分化研究简况
如：指（趾）间隙的形成
2、维持内环境稳定
如：清除受损、突变或衰老的细胞
3、防御功能
如：使受到病毒感染的细胞凋亡
是生理性、主动性过程。确保正常发育，生长，维持内环境稳定，发挥积极的防御功能
衰老（aging)：机体的形态、结构和生理功能逐渐衰退的现象。
凋亡与的区别：
凋亡：
1.细胞可由G1期进入S期，启动DNA合成
TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。
（二）缺口翻译（nick translation）
撤除饲养层细胞后，常规培养液中加入LIF(白血病抑制因子)或含有LIF的BRL（大鼠肝实质）细胞条件培养液，保持细胞体外增殖但不分化的生长状态。
2.胚胎细胞来源
超排卵技术获得
超排卵(控制的卵巢刺激)以药物的手段在可控制的范围内诱发多卵泡的成熟、排卵。
胚胎3~4d——ES细胞
胚胎8~10d——EG细胞
3. ES、EG细胞培养过程（简略介绍）
4. ES、EG细胞系特性和鉴定
（1）形态学特征
圆形或卵圆形细胞、岛状或巢状群体生长
（2）发育全能性和分化潜能
SSEA-1抗原、碱性磷酸酶（AKP）、OCT-4基因表达、体外分化潜能、体内分化
（3）嵌合体动物
胚胎聚集法、显微注射法
三、ES细胞体外诱导分化
1.意义：
BH3亚家族：Bik、Blk、Hrk、BNIP3、Biml、Bad、Bid；仅有BH3结构域。它们的作用也与Bcl-2亚家族的作用相反，可促进细胞凋亡。
作用机制：影响APAF1的功能影响线粒体的结构与功能
2．P53与细胞凋亡
P53是肿瘤抑制基因，其产物主要存在于细胞核内。P53基因是人类肿瘤有关基因中突变频率最高的基因。在依赖P53蛋白的细胞凋亡中，P53基因是通过调节Bc1-2和Bax基因的表达来影响细胞凋亡的。P53蛋白能特异地抑制Bc1-2的表达，相反对Bax的表达则有明显的促进作用。研究表明，P53蛋白是Bax基因的直接的转录活化因子。在这些细胞中，P53蛋白的积累和活动引起了细胞凋亡。
参考资料
（含教科书、参考书、网站、视频以及参考文献等）
组织与细胞培养技术章静波主编人民卫生出版社
教学图片来源于网络
教学过程
时间分配
基本点：以学生为中心启发式教学；方式：（1）引言：上节课总结，新课与上次课的内容衔接，本节课重点提示；（2）通过阐述、引导、分析、案例、讨论与辩论等规划教学过程；（3）内容归纳与思考题布置
（三）末端标记电泳法
核素标记3’末端→凋亡细胞中提取DNA→放射性自显影
优点：敏感度高
在密度仪测定下进行定量和半定量检测
三、细胞凋亡的免疫化学分析法
（一）TUNEL测定法（DNA断裂的原位末端标记法）
染色体DNA断裂产生大量粘性3‘-OH末端，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素衍生物标记到DNA的3’-末端，进行凋亡细胞检测的方法称脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，故没有3‘-OH形成，很少能够被染色。