培养条件
(1)、无菌、无毒的环境 （添加一定量的抗生素、定期更换培养液 ）
(2)、培养基 葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血 清等
动物细胞生长特性
细胞贴壁： 悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上， 称为细胞贴壁。 要求： 培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。 细胞的接触抑制： 当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就 会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。
细胞体外培养技术
沈怡彤 宋瑞鑫 孙佳丽 王辰 王贺申 王君雅
概
况
从机体中取出组织或细胞，模拟机体内的生理条件在体 外进行培养，使之生存和生长，称之为组织培养。组织培养 技术在流感病毒研究及监测等方面的应用已越来越引起人们 的重视。因近来发现，用组织培养细胞所分离到的流感病毒，
其抗原性和基因特性要比用鸡胚分离到的更接近原始采集的
单细胞的制备
贴壁生长的传代细胞使之分散成单细胞的方
法有 酶消化法 螯和剂分散法
酶消化法
胰蛋白酶能消化细胞间的蛋白质成分， 组织块受它作用后细胞变为圆形，再用吸管 机械吹打或电动搅拌细胞可分散 胰蛋白酶用的浓度过大或时间过长对细 胞均有损伤，影响细胞的生长。因此，不同 组织来源、不同年龄的动物组织所用酶的浓 度和时间可以不同。 通常用0.25%-0.5%的酶。
过程
1）准备阶段 查阅相关文献，根据已成功培养的相近植物资料，结合实际制 订出切实可行的培养方案。然后根据实验方案配制适当的化学 消毒剂以及不同培养阶段所需的培养基，并经高压灭菌或过滤 除菌后备用。 （2）外植体选择与消毒 选择合适的部位作为外植体，采回后经过适当的预处理，然后 进行消毒处理。将消毒后的外植体在无菌条件下切割成一定大 小的小块，或剥离出茎尖，挑出花药，接种到初代培养基上。 （3）初代培养 接种后的材料置于培养室或光照培养箱中培养，促使外植体中 已分化的细胞脱分化形成愈伤组织，或顶芽、腋芽直接萌发形 成芽。然后将愈伤组织转移到分化培养基分化成不同的器官原 基或形成胚状体，最后发育形成再生植株。
合成培养液
以前多用天然培养液，现在多用合成培 养液。合成培养液有多种，如Eagle氏液、 1640、199、DMEM等，其主要成分为氨基酸、 糖、维生素、无机盐及其他成分。
合成培养液中不含蛋白质成分，血清蛋白对组织培养 是不可缺少的，不仅能促进细胞增长且能帮助细胞贴 壁。不同血清对细胞促进作用不同。以.0—7.4。细胞可忍 受较大的范围PH变化（PH6.6—7.8）培养环境偏酸 较偏碱更宜于细胞贴壁。培养液中的缓冲体系主要 是碳酸氢盐、磷酸氢盐和血清。其中碳酸氢盐/CO2 为主要的缓冲体系，如使用CO2孵箱，能提供稳定 的5%CO2，可自动调节细胞代谢引起的PH改变。 另外，在培养液中加入氢离子缓冲剂，如 HEPES可使培养液有较强的缓冲能力。
（4）继代培养 分化形成的芽、原球茎数量有限，采用适当的继代 培养基经多次切割转接。当芽苗繁殖到一定数量后， 再将一部分用于壮苗生根，另一部分保存或继续扩 繁。进行脱毒苗培养的需提前进行病毒检测。 （5）生根培养 刚形成的芽苗往往比较弱小，多数无根，此时可降 低细胞分裂素浓度或不加，提高生长素浓度，促进 小苗生根，提高其健壮度。 （6）炼苗移栽 选择生长健壮的生根苗进行室外炼苗，待苗适应外 部环境后，再移栽到疏松透气的基质中，注意保温、 保湿、遮荫，防止病虫危害。当组培苗完全成活并 生长一定大小后，即可移向大田用于生产。

可消除其他外界因素的影响，对疫苗生产来说其 抗原性更接近于自然流行株
可减少宿主蛋白成分，减少变态反应

细胞培养的基本条件
接种细胞量
培养液
氢离子浓度及气体条件 温度 无菌条件和培养器皿的清洁
度
细胞接种数
一般来讲，细胞量越大繁殖的速度越 快，但太大的细胞量对于生长亦不利。传 代细胞一般为10—30万/ml，细胞一般可在 3—7天长成单层
过程
动物细胞培养应用
大规模培养生产生物制品（病毒疫苗、干
扰素、单克隆抗体） 作为基因工程中的受体细胞 培养的动物细胞可以用于检测有毒物质， 判断某种物质的毒性 为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依 据
植物组织培养
植物的组织培养是根据植物细胞具有全能性
这个理论，近几十年来发展起来的一项无性 繁殖的新技术。植物的组织培养广义又叫离 体培养，指从植物体分离出符合需要的组织。 器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作， 在人工控制条件下进行培养以获得再生的完 整植株或生产具有经济价值的其他产品的技 术。
细胞的全能性 固体培养基
细胞增殖 液体培养基
蔗糖、植物激素 葡萄糖、动物血清
培养结果
培养目的
植物体
快速繁殖、培育 无病毒植株等
细胞株、细胞系
获得细胞或细 胞产物
温 度
细胞培养的最适温度与细胞来源的动物 体温一致，温度增加2—3℃对细胞产生不 良影响，低温对细胞影响较小
无菌条件
细胞培养技术的关键之一是防止 污染，在细胞培养中，可能发生 污染的来源有： 组织培养液
器皿
组织本身
工作者本身
空气
培养器皿的处理
常用的主要器皿：玻璃、塑料
玻璃器皿一般须用清洁液浸泡，清水洗10 次后再用蒸馏水洗2次，烤干备用
组织培养的步骤
准备细胞生长液 清洗细胞
消化细胞
加入生长液，混匀，分装细胞瓶
分类
动物细胞组织培养
植物细胞组织培养
动物细胞组织培养
动物细胞培养就是从动物机体内取出相关 的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适 宜的培养基中让这些细胞生长和增殖。
选材：动物胚胎或幼龄动物的组织、器官 它们细胞增殖能力强，分裂旺盛， 分化程度低，容易培养。
组织培养的材料
1．生长成片的MDCK细胞 2．T-75细胞培养瓶, 颈口有倾角。 3．D-MEM培养液 4．青、链霉素母液(10,000 U/ml 青霉素 G；10,000 µg/ml 硫酸链霉素) ，分装后保存于-20 ℃。 5．HEPES 缓冲液, 1 M 母液。 6．胎牛血清，40 nm滤过。 7．EDTA-胰酶 (0.05% 胰酶；0.53 mM EDTA . 4Na)，分 装后保存于-20 ℃ 8．牛血清白蛋白组分V, 7.5%溶液。 9．1ml 、10ml无菌移液管 10．70％～75％的酒精
标本，故世界卫生组织号召大家寻找合适的细胞来制备流感 病毒疫苗，来替代鸡胚制备疫苗。最近我国发现，“O”相流 感病毒株在人群中消失30余年后，又重新出现，同时还发现 用组织培养细胞来分离“O”相毒株要比鸡胚系统敏感的多。
细胞培养的主要优点

可提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象， 比较经济，方便

应用
在农业领域中的应用
自六十年代后期起，植物组织培养技术得到 了迅猛的发展，在农业上的应用主要包括以 下几个方面： 植物种质资源的保存、植物种质资源的创新、 植物优良品种的快繁、 应用植物培养细胞生 产次生代谢物
植物组织和动物细胞培养的比较
比较项目 植物组织培养 动物细胞培养
原理
培养基性质 培养基特有成分