800kb，其中T-DNA区为12-24kb，vir区 有35kb，T-DNA上有tms、tmr和tmt三套 基因，分别编码合成植物生长素、分裂 素和生物碱的酶。在T-DNA两端各有一 个25bp的末端重复序列LB和RB，在TDNA的切除及整合过程中起着重要作用。
载体介导法
➢ T-DNA区可高效整合到植物受体细胞的 染色体上并得到表达。利用这一特点， 将目的基因转入Ti质粒的T-DNA区构建 根瘤农杆菌的转化载体。
一、转基因植物
通过植物基因工程获得转基因植物在农 业生产发展及植物分子生物学研究中有 十分重要的意义，已获得的有重大经济 价值的转基因植物已经很多。
一、转基因植物
基因工程： 就是重组DNA技术，指在体 外将不同来源的DNA进行剪切和重组， 形成杂合DNA或成嵌合DNA分子，然后将 其导入特定的宿主细胞从而得到大量扩 增和表达，使宿主细胞获得新的遗传特 性，产生新的基因产物。
载体介导法
Vir区（virulence region）： ➢ 该区段上的基因能激活T-DNA转移，
使农杆菌表现出毒性，故称之为 毒性区。T-DNA区与Vir区在质粒 DNA上彼此相邻，合起来约占Ti质 粒DNA的三分之一。
Ti质粒的基因位点及其功能区域
➢ T-DNA区（transferred-DNA regions）：
产生白化苗，且由于 PEG法对原生质体活力 有害，转化率低。
应用这种方法已成功的获得大麦、柑桔、胡
椒等植物的转基因植株。
一、转基因植物
载体介导法 具体方法有农杆菌介导法、病毒介导法。 农杆菌介导可采用“共培养法”，(见
书本图10-1 B)，有根癌农杆菌和发根农 杆菌两种载体系统。
载体介导法
以野生型根癌农杆菌载体系统为例： ➢ 野生型根癌农杆菌Ti质粒大小约200-
发现农杆菌是与根癌农杆菌同属的一种 病原土壤杆菌，含有Ri质粒，可以诱导植物 细胞产生毛状根，毛状根细胞能分化形成植 株。
由于Ri质粒也含有可高效整合到植物受 体细胞的染色体上并得到表达的T-DNA，因 此也可用作转基因植物的载体。
花粉管通道法
花粉管通道法又称子房注射法，是在植 物授粉后，将外源DNA注人子房的胎座 位置，使DNA沿着花粉管通道进入胚囊 与受精卵或者胚细胞接触而达到转化目 的。
一、转基因植物
2、载体 载体：是目的基因的运输工具，它
能将分离克隆得到的目的基因导入 植物细胞并使其整合到寄主染色体 组中得以表达。
一、转基因植物
载体种类：
（1）目的基因克隆载体：目的基因克隆载 体与微生物基因工程类同，通常是由多拷 贝的E.coli小质粒为载体，其功能是保存 和克隆目的基因。 （2）中间克隆载体：中间克隆载体是由大 肠杆菌质粒插入T－DNA片段及目的基因、 标记基因等构建而成。它是构建中间表达 载体的基础质粒。 （3）中间表达载体：中间表达载体是含有 植物特异启动子的中间载体，其功能是作 为构建转化载体的质粒。
➢ 第三个因素是受体材料的选择
一、转基因植物
基因枪法优点： ①不受受体种类个 以上的质粒进行共转化，而不需构建一 个复杂的质粒 ③快速简便，转化率较高。
化学物质诱导法
➢化学物质诱导法是以原生质体为受体,借助于
特定的化学物质诱导DNA直接导入植物细胞的 方法。常用的转化细胞的化学物质有PEG(聚 乙二醇)、PLO(多聚鸟氨酸)、 PVA(聚乙烯醇) 等,其中PEG法应用较多,效果较好。
一、转基因植物
（3）悬浮细胞:单个细胞易于操作， 性状稳定。
（4）愈伤组织:属于分生细胞，易于 接受外源基因。
（5）胚状体:胚状体起源于单细胞， 嵌合现象不易发生。
一、转基因植物
（6）活体:在植株上形成新鲜伤 口，接种根癌农杆菌转化载体， 得到再生芽。
（7）胚轴、茎尖、茎段等也可以 作为转化受体。
液体MS浸泡15min
无生长素N6-AS共培养 3d
N6-H选择培养20d
抗性愈伤组织的获得及植株再生 30d
优化的农杆菌介导法水稻遗传转化过程
1 2N6愈伤诱导 2 N6-BA预培养 3 N6-H选择培养
4 植 株 再 生
载体介导法
根癌农杆菌转化植物细胞的过程大致包 括： 1、农杆菌对植物细胞表面特定部位的识 别和附着 2、经敏感细胞的诱导作用，位于Ti质粒 上控制T区的基因转移的Vir区基因活化 并表达 3、T-DNA从Ti质粒上切割下来，通过细 菌和植物细胞的壁，转移并整合到植物 细胞的核基因组中。
Ti质粒介导的共整合转化系统
（3）将重组大肠杆菌与含野生型Ti质粒的根癌 农杆菌进行结合，通过同源重组，T-DNA质粒整 合到Ti质粒上得到重组根癌农杆菌，利用根癌 农杆菌筛选标记筛选。 （4）将得到的整合型根癌农杆菌感染植物愈伤 组织，携带大肠杆菌重组质粒的T-DNA便随机整 合在植物细胞染色体上，采用含卡那霉素的培 养基筛选出植物细胞转化子。 该方法存在载体构建困难、效率低等不足。
分
目的基因
基因载体
切
接
重组体
转 筛
总 体基 技因 术工 路程 线
表
一、转基因植物
转基因方法
概括起来说主要有两类： 第一类是外源目的DNA的直接转化。 第二类是以载体为媒介的遗传转化， 也称为间接转移系统法。
一、转基因植物
转基因方法
直接导入法
可以采用物理或者化学方法直接将外源目 的基因导人植物细胞。 物理方法包括基因枪法、电击法、超声法、
一、转基因植物
技术路线
目的基因分离 植物表达载体的构建 受体材料的准备
遗传转化
炼苗
转化组织 转化植株筛选 组织脱分化
一、转基因植物
1、受体 受体材料的选择 （1）叶盘:从幼嫩新鲜的植物叶片上用
打孔器取下直径约5mm的圆形叶片 （叶盘）作为外源DNA的转入受体。 （2）原生质体:无细胞壁易于接受外源 基因，同时细胞璧再生后可以再生完 整植株。
病毒感染法
病毒可以感染植物组织，不受双子叶和 单子叶限制，作为植物转荃因载体的病 毒包括单链RNA病毒、 单链DNA病毒和 双链DNA病毒。
较为成熟的是花椰菜花斑病毒（CaMV） 和番茄金花叶病(TGMV )。
转基因植物鉴定
一般情况下，在受体细胞群中只有少部 分细胞获得了外源目的基因，而目的基 因被整合到受体细胞基因组并实现表达 的更少。因此必须从转化体系中筛选出 含有目的基因的重组体。 ➢常用方法包括:选择性培养检测、报告
射击植物
决定基因枪使用成功的因素
➢ 第一因素是动力系统
根据动力系统，基因枪分为三大类：一类是以 火药爆炸力作为动力加速微弹；第二类是以电 弧放电蒸发浪作为动力；第三类是以高压气体 作为动力。
➢ 第二因素是微弹的制备过程 。用的微
载体有两类：一是钨粉，另一个是金粉，直 径一般为0.6－4μm。 常用的将DNA包被到微载体上所用的沉淀试剂 有亚精胺、氯化钙、乙醇、聚乙二醇、异丙醇 等。
载体介导法
（二)Ti质拉介导的二元整合转化系统 由两个分别含有T-DNA和vir区的Ti微型
质粒和辅助质粒构成，通过反式激活T-DNA转 移至植物细胞基因组内。
微型Ti质粒小，转移到农杆菌比较容易， 载体容易构建，效率较高。这是目前T-DNA转 化植物细胞比较常用的方法。
Ti质拉介导的二元整合转化系统
共整合载体和农杆菌质粒重组过程
Ti质粒介导的共整合转化系统
（1）将删除tms、tmr和tmt基因的T-DNA片段克 隆到大肠杆菌载体质粒pBR322上（有氨苄青霉素 抗性标记) （2）然后分别插人新霉素磷酸转移酶(NPTⅡ)基 因(卡那霉素抗性)和根癌农杆菌筛选标记，接入 外源基因，转化大肠杆菌，利用氨苄青霉素 （Apr）筛选阳性克隆。
Ti plasmid of Agrobacterium causes crown gall tumors
T-DNA contains: 1) opine systhesis genes 2) iaaM, iaaH—auxins 3) iptZ--phytohormone
100多种双子叶植 物！很少感染单子 叶植物！
显微注射法和激光微束法等。 化学方法包括PEG法、脂质法等。
一、转基因植物
基因枪法最早是由 美国康奈尔大学 Sanford最先提出的。 1992年，世界首例 转基因小鼠就是通 过该法获得的。
一、转基因植物
基因枪法(gene gun bombardment)又称粒子轰
击(particle bombardment)，高速粒子喷射技术 (high-velocity particle microprojection)， 经过加速装置用表面附着DNA分子(含目的基因） 的金属微粒轰击植物细胞，将DNA直接射入植物 细胞。
第十章
转基因植物
主要内容
一、转基因植物 受体 转基因方法 转基因植物鉴定
二、基因改良植物 抗虫害植物 抗除草剂植物 高品质植物
三、转基因植物生物 制药
四、转基因植物的安 全性问题
一、转基因植物
转基因植物(transgenic plant)是指将外 源基因转入到植物的细胞或组织中获得 的具有新的遗传性状的植物。
基因枪法
基因枪法进行遗传转化的步骤： 1、靶细胞或组织的预处理：渗透压
调节（甘露醇、山梨醇） 2、质粒DNA的提取与纯化 3、微弹头的制备（质粒DNA浓度、
金粉颗粒处理） 4、轰击 （距离、压力） 5、抗性愈伤组织的诱导与筛选 6、植株再生与转化体筛选
吸附
装入
DNA 1.2m钨弹头 特制手枪
➢PEG是细胞融合剂，在磷酸钙、高pH条
件下引起原生质细胞膜表面电荷紊乱带 来通透性改变从而有助于细胞摄取外源 DNA。
化学物质诱导法
PEG法优缺点：
优点
➢PEG法操作简单、成本低、结果较稳定、重