实验部分：安全注意事项
实验室内必须戴专用安全眼镜 实验室内必须穿实验服 办公区内不准穿实验服 实验室内动手做实验前必须戴手套
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实验部分：分组
组 姓名 岳麓 邢士超 张稷 #1 陈建 韩晓红 王帅 #2 吴传勇 李喆 冯芬 #3 时利 组 姓名 刘毅 王高文 #4 李建民 王玉艳 谭小军 张晔 #5 李喆 蔡旭
石蜡组织切片DNA抽提
鹿亚超/ Peter Lu
阿斯利康中国创新研究中心 (ICC) 2010.04.11
ANNUAL BUSINESS REVIEW
概览
EGFR 突变检测申请 病理学评估 DNA 抽提
样品处理
DNA 定量（质控）
EGFR突变检测
DNA测序
ARMS
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内容
1. EGFR 突变检测申请 2. 样品处理 3. DNA抽提
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DNA抽提前
福尔马林固定石蜡包 埋组织(FF-PET)
病理学评估 确认肿瘤细胞 数大于50
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3. DNA 抽提
福尔马林固定石蜡包埋组织
受破坏DNA（固定步骤）
降低DNA 得率
后续分析困难
需要可靠的DNA抽提方法
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DNA抽提方法
• 商业试剂盒 vs. 实验室固有方法
试剂盒 质控情况 方便性 成本 DNA质量 经过质控 方便 高 取决于方法 实验室固有方法 可能有内部质控 不方便 低
• 一般，DNA质量越高的方法，DNA得率越低。 • 需要样品量：4~5cm25µm
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Qiagen QIAamp DNA Mini Kit
订购方便 已质控试剂盒 DNA得率相对较高
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QIAamp Mini Kit Procedure
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石蜡组织切片DNA提取：实验原理
2.组织切片刮取
3.加热裂解消化DNA
4.去除石蜡
通过离心石蜡将悬浮于裂解液上层，吸取 石蜡层下的溶液，注意吸取时应尽量小心
以避免吸入石蜡等污染物
5.吸附柱收集DNA
使用QIAgen吸附柱收集
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该方法优点


无需二甲苯脱蜡，避免对实验人员的伤害 采用加热与吐温蛋白酶K结合，充分裂解胞核消化DNA 采用QIAgen吸附柱有效快速收集DNA，减少PCR抑制剂影响
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石蜡组织切片DNA提取步骤
1.石蜡组织切片收集 及鉴定
每个样本以约4~5cm25µm的石蜡组织切 片量为宜，每张片子应由病理医生进行 病理鉴定，并圈出肿瘤区域 使用一次性解剖刀从组织片中刮取石蜡 组织至离心管中，尽量防止组织碎片飞 散造成交叉污染 通过吐温20释放使DNA从细胞核中释放， 蛋白酶K消化组蛋白,消化裂解过夜，期 间至少重复加入4µL 10mg/mL蛋白酶K两 次，每次间隔1小时以上
加热法&QIAgen DNA试剂盒： 通过高温结合吐温20以及蛋白酶K使DNA从石蜡组织中裂解 释放，并通过DNA吸附柱有效提取DNA 关键点：

吐温20：非离子型变构剂, 裂解细胞核释放DNA 蛋白酶K：消化与DNA结合的组蛋白
DNA吸附柱：有效快速收集DNA，有效减少PCR反应抑制剂对后续实 验的影响

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控制交叉污染
必须严样品用一个解剖刀片
实验前后清洁工作区 经常换手套
无PCR产物区域
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核心信息
可靠的样品追踪记录 DNA质量不高 （FFPET样品） 可靠的DNA抽提方法方便后续
EGFR突变分析
控制样品间交叉污染
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样品处理
EGFR 突变检测申请 病理学评估 DNA 抽提
DNA 定量（质控）
EGFR突变检测
DNA测序
ARMS
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1. EGFR 突变检测申请
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样品处理
组织蜡块
切片
病理学评估
DNA
实验/数据
存放位置, 使用情况, 是否返还 样品移交记录（实验室间）
LIMS (实验室信息管理系统) Microsoft Excel or Access 手写记录