藻蓝蛋白的提取方法
1.PBS 缓冲液直接提取法
(1)配制pH=6.0 的PBS 缓冲溶液。

(2)称取20 g 螺旋藻粉, 加入步骤( 1) 配制的缓冲溶液200 mL, 然后将其放
在磁力搅拌器上搅拌 4 h, 将搅拌后的溶液置于离心机中10 000 g 离心10 min, 收集蓝色上清液。

(3) 将离心得到的上清液加洗涤剂洗涤, 再将洗涤后溶液进行过滤。

(4)将滤液用旋转真空蒸发仪蒸干, 可得蓝色固体,将固体置于干燥器中 1 h, 待完全干燥后取出, 将其研磨成蓝色粉末样品。

2藻蓝蛋白的富集分离
2 .1螺旋藻细胞的破碎
准确称取0 .5 g 螺旋藻粉, 加入100 mL 的pH =7 .0 、0 .01 mol/L 的H3PO4 缓冲液, 采用反复冻融(3 次)的方法对藻体细胞进行破碎, 在显微镜下观察计数细胞破碎率在90%以上即可.将破碎的螺旋藻细胞悬浊液于4 000 r/min 离心20min , 倾倒上清液可得到含藻蛋白的粗提液.在568 、620 和650 nm处测粗提液的吸光度, 计算藻蓝蛋白的含量.
2.2 盐析法沉淀藻蓝蛋白
在装有固定体积藻蛋白粗提液的烧杯中加入一定量的(N H4)2SO4 溶液, 边加边搅拌, 以防溶液局部过浓使蛋白质发生变性, 最终(NH4)2 SO4 溶液的质量浓度分别为20 %、40 %、50 %和60 %, 然后分别在20 ℃和40 ℃下对(NH4)2 SO4 盐析法沉淀藻蓝蛋白进行实验研究.在设置的温度和盐浓度下静置过夜, 再于-4 ℃离心机中以10 000 r/min 离心20 min , 将离心得到的沉淀用1/4 上清液体积的
H3PO4 缓冲液(pH =7 .0)溶解, 并倾倒于透析袋中, 再置于去离子水中透析24
h(每隔4 h 更换一次去离子水);透析结束后, 再于-4 ℃离心机中以10 000 r/min离心25 min ;用移液管抽取上清液,在568 、620 和650 nm 下测吸光度, 计算藻蓝蛋白的含量.
2 .
3 等电点法沉淀藻蓝蛋白
在装有固定体积藻蛋白粗提液的烧杯中加入0 .1 mo l/L 稀H2 SO4 溶液, 边加边搅拌,
以防溶液局部过浓使蛋白质发生变性, 将藻蛋白粗提液pH调节为3 .0 、4 .0 和
5 .0 , 即藻蓝蛋白的等电点附近,静置过夜, 于-4 ℃离心机中以10 000 r/min 离心20 min ;将离心得到的沉淀用1/4 上清液体积的H3PO4 缓冲液(pH =7 .0)充分溶解, 再于-4 ℃高速离心机中以10 000 r/min 离心25 min ;用移液管抽取上清液,
在568 、620 和650 nm 下测吸光度, 计算藻蓝蛋白的含量.
2 .4 藻蓝蛋白的收率和分离因数
分别计算藻蓝蛋白的收率(Y )、浓缩率(m)和分离因数(β):
式(3)-(5)中, N(g/L)为藻液比, 0 和t 分别代表冷冻-融化后藻蛋白粗提液和经过盐析法沉淀或等电点法沉淀最终得到的藻蓝蛋白上清液.
双水相萃取
（1）藻蓝蛋白的初步提取。

准确称取8g钝顶螺旋藻粉，加入100mL去离子水，采用-21℃冷冻、4℃:融化的反复冻融法对螺旋藻进行细胞破碎，在显微镜下观察细胞破碎率达90%以上。

将破壁的细胞悬浮液在4000r/min条件下离心20min，取上清液，加入硫酸铵，使溶液饱和度达到25%，离心，弃沉淀，上清液再加硫酸铵至55%饱和度。

4℃静置12h，离心，沉淀用含0.002M EDTA、pH=6.7的磷酸盐缓冲液溶解，在波长280、620、650nm下测其吸光度。

（2）双水相萃取。

室温下在10mL 尖底带盖离心管中将一定量的酒石酸钾钠和PEG混合，加入上述获得的藻蓝蛋白粗提液2mL，用去离子水调节至双水相总质量为10g，于漩涡混匀器上混合3min，静置30min，在2000r/min条件下离心1min，加速系统分相，测量上相和下相体积。

用胶头滴管吸取上下相溶液。

在波长280、620、650nm下测其吸光度，计算藻蓝蛋白的质量浓度和纯度。

（3）分析方法。

螺旋藻中以藻胆蛋白吸收光谱的差异作为其测定标准。

藻蓝蛋白在620nm处有最大光吸收值，其含量测定参考Bennett and Bogorad 的相关研究。

在双水相系统萃取藻蓝蛋白中，藻蓝蛋白富集于双水相系统的上相，因此计算藻蓝蛋白分配系数（K）、回收率（Y）、相比（R）和纯度（EP）如下式：。