β-葡萄糖苷酶水解银杏黄酮糖苷的研究伍毅1,王洪新1,2*(1.食品科学与技术国家重点实验室,江南大学食品学院,江苏无锡214012;2.石河子大学食品学院,新疆石河子832003)摘要采用β-葡萄糖苷酶水解银杏叶提取物(G BE),使糖苷型黄酮转化为苷元型黄酮。
通过正交试验得出水解的最佳工艺参数,即温度40℃,酶浓度5×10-3m g/m l,pH值5.0下水解6h。
由H P L C图谱可得该条件下水解的苷元得率9.08%,纯度68.24%。
酶解产物中还部分保留了银杏内酯等活性成分,有利于保留银杏叶提取物的综合生物活性。
关键词银杏叶提取物;黄酮苷元;β-葡萄糖苷酶;水解中图分类号Q946文献标识码 A 文章编号0517-6611(2008)01-00030-03S tud y on H y dro ly z in g G in k go F la v on e G ly c o s id e w ithβ-g ly c o s ida seW U Y i e t a l(S ta te K ey L abo ra to ry o f F o od S cien ce an d T e chn o lo gy,S ch oo l o f F o od S cien ce&T ech n o log y,S ou th e rn Y an g tze U n ive rsity,W u x i,J ian gsu 214012)A b s tra c tβ-g lyco sidase w a s u sed to h yd ro ly ze th e ex tract fro mg in k go lea ves to tran s fo rmflavon e g lyco side in to flavon e a g lycon e.T h e op ti m umtech n o-log ica l pa ram e te rs o f h yd ro lys is w e re obta i n ed th rou gh o rth o gon a l expe r i m en t,w h ich w e re en zym e con cen tra tion o f5×10-3m g/m l an d pH v a lu e o f5.0,h ydro ly sis tem pe ra tu re o f40℃an d ti m e o f6h.It w as k n ow n from H P L C spectrog ramth a t th e ag ly con e y ie ld o f h ydro ly sis u nde r th is con d ition w a s9.08%w ith pu r ity o f68.24%.In th e en zym o lys is p rodu cts,th e a ctive in g redien ts su ch a s g i n k go la cton e w e re a lso rese rved pa r tly,w h ich w as i nfa vo ro f re se rv in g th e syn th e sized b io activ ity o f g in k go lea ves ex tract.K e y w o rd s G in k go lea ve s ex tract;F la von e ag ly con e;β-g ly cos idase;H yd ro ly sis银杏(G inkgo b iloba L.)属银杏科银杏属多年生落叶乔木,是冰川时期存活的孑遗植物之一,属我国特产植物,主产于河南、湖北等地,其种子、根、叶均可药用。
银杏叶中含有丰富的黄酮类物质,,主要是由山奈酚、槲皮素以及异鼠李素等黄酮苷元与葡萄糖等单糖以O-糖苷键联接而成,具有广泛的药理作用,是极好的天然抗氧剂。
现代研究表明,银杏黄酮被水解成苷元后清除人体氧自由基的生物活性要明显高于黄酮糖苷,黄酮苷元的效价是黄酮糖苷效价的7倍[1-2]。
因此,改善黄酮的构型是提高银杏黄酮在人体内吸收率的重要途径。
笔者采用生物酶法水解银杏黄酮,生成了具有更高生物活性的苷元型黄酮,而且具有环保、反应条件温和等优点。
1材料与方法1.1材料银杏叶提取物(G BE),黄酮含量≥24%,由上海宝丰生物有限公司提供。
β-葡萄糖苷酶由西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司提供。
槲皮素标准品,纯度≥99.0%,由上海康九化工有限公司提供。
1.2 GBE的酶解工艺[3]称取5m gβ-葡萄糖苷酶,用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液(pH值5.0)定容至100m l。
然后,称取一定量的银杏叶提取物,适量甲醇溶解,加入缓冲溶液和酶,置于水浴锅中恒温水解,将水解液高速离心、过滤后,沉淀用无水甲醇溶解,再上旋转蒸发器以除去多余的溶剂,恒重后用10m l无水甲醇充分溶解得样液,0.45μm滤膜过滤后待测定。
1.3 总黄酮苷元的测定方法1.3.1分析条件[4]。
色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶柱(15 m m×6.0m m,5μm);柱温:30℃;流动相:甲醇∶水(0.5%磷酸)梯度洗脱;流速:1m l/m in;检测波长:368nm;进样量:10μl。
1.3.2 计算方法。
由文献可知,对照品溶液、换算因子的选用不同对测定结果的影响较小。
同时,受对照品来源的限制,3种苷元的定量分析都可以用槲皮素标准物的标准工作作者简介伍毅(1983-),女,四川通江人,硕士研究生,研究方向:食品功能性成分。
*通讯作者。
收稿日期2007-08-21曲线进行定量分析[5]。
计算公式如下:C(%)=[(A1+A2+A3)×K+B]×VW×100%(1)式中,A1为槲皮素峰面积(m A u);A2为异鼠李素峰面积(m A u);A3为山奈酚峰面积(m A u);K为槲皮素标准曲线斜率(m g/m l);B为槲皮素标准曲线截距;V为样品溶液体积(m l);W为样品重量(m g)。
1.3.3 槲皮素标准曲线的制作[6]。
准确称取对照品槲皮素0.02g,置于100m l容量瓶中,用甲醇定容至刻度,得槲皮素标准储备液(0.20m g/m l)。
用移液管分别取槲皮素标准储备液2.5、5、10、20、40m l,用无水甲醇定容至50m l容量瓶,得0.01、0.02、0.04、0.08、0.16m g/m l的标准溶液。
分别取标准溶液和储备液进样10μl,测定峰面积。
根据标准品的浓度和峰面积可得回归方程:y=7×10-5x-0.0058(2)r=0.99(n=5),线性范围为0.01～0.10m g/m l。
1.4 单因素试验影响酶解工艺效果的因素主要有时间、温度、酶浓度及pH值等[7]。
该试验分别研究了不同因素对GB E酶解效率的影响。
1.5 最佳工艺参数的确定在单因素试验的基础上,为了进一步确定反应的最优条件以及影响因素的主次,采用正交试验设计方法进行优化[8]。
表1为酶解试验正交试验因素水平表。
表1 酶解正交试验因素与水平T a b le1 F a c to rs a n dle v e ls o f o rth o g on a l te s t fo r e n zym o ly s is 水平L ev e lA(温度)T em pe ra tu re℃B(时间)T i m e∥hC(pH值)pHv a lu eD(酶浓度)E n zym e co n ce n tra t ionm g/m l 130540.025240650.005350760.0102结果与分析2.1 酶解单因素试验结果2.1.1 酶解时间的选择。
图1是固定酶解温度40℃,pH值安徽农业科学,J ou rn a l o f A n h u i A g r i.S c i.2008,36(1):30-32责任编辑刘月娟责任校对马君叶5.0,酶液用量为1m l 即酶浓度为0.005m g/m l 时,水解3、4、5、6、7、8h 对酶解效率的影响。
从图1可以看出,当水解时间达到6h 时,水解效率最高;当水解时间超过6h ,水解基本趋于平衡,苷元含量不再增加。
所以,选择水解时间为6h 。
图1 酶解时间对酶解效率的影响F ig.1 E ffe c ts o f e n zym o ly s ist i m e o nth e e ffic ie n c y o f e n z ym a t ic h y -d ro ly s is2.1.2 酶解温度的选择。
图2是固定酶解时间6h ,pH 值5,酶液用量为1m l 时,温度对酶解效率的影响。
如果温度低于酶的最适温度,则酶的活力大为降低;而如果温度高于酶的最适温度,则酶可能变性失活,降低甚至失去催化能力。
从图2可以看出,随着酶解温度的升高,酶解效率逐渐增加,在40℃时达到最大值;之后,随着温度的升高,酶解效率明显下降。
这可能是由于随着温度的升高,β-葡萄糖苷酶的活力下降所致。
所以,选择酶解温度为40℃。
图2 酶解温度对酶解效率的影响F ig.2 E ffe c ts o f tem p e ra tu re o n e n zym o ly s is e ffic ie n c y2.1.3 pH 值的选择。
图3是固定酶解时间6h ,温度为40℃,酶液用量为1m l 时,pH 值对酶解效率的影响。
从图3可以看出,苷元含量随着pH 值的增加而不断提高,并且在pH 值为5时达到最大值,此后苷元含量急剧下降,说明β-葡萄糖苷酶在pH 值5左右酶解活力最高。
所以,选择水解液的pH 值为5。
2.1.4 酶浓度的选择。
图4是固定酶解时间6h ,温度为40℃,pH 值5时,不同酶浓度对酶解效率的影响。
从图4可以看出,苷元含量随着酶浓度的增大而增加,但是酶浓度达到5×10-3m g/m l 时,黄酮苷元基本不再增加。
这可能是由于在该酶浓度下酶与底物的结合已趋饱和。
所以,采用酶浓度为5×10-3m g/m l 。
2.2 酶解条件的优化 从表2可以看出,影响酶解效率因素的主次顺序为B>C>A>D 。
所以,优化后的酶解条件为A 2B 2C 2D 2,即当温度40℃,酶浓度5×10-3m g/m l ,在pH 值5的水解液中水解6h ,生成的苷元含量可达到18.35%。
图3 pH值对酶解效率的影响F ig.3 E ffe c ts o f pH v a lu e on e n zym o ly s is e ffic ie n c y图4 酶浓度对酶解效率的影响F ig.4 E ffe c ts o f e n zym e c o n c e n tra t io n o n e n zym o ly s is e ffic ie n c y表2 酶解正交试验结果T a b le 2 R e s u lts o f o r th o g o n a l te s t fo r e n zym o ly s is序号N o.水平L e ve lA B C D 苷元含量A g ly co n e con ten t ∥%11 1 1 1 9.342122216.523133311.714212313.455223114.59623129.58731329.728321310.64933219.83k 112.5210.839.8511.25k 212.5413.9213.3011.94k 310.0610.3712.0011.93R2.483.553.450.692.3 酶解前后银杏叶提取物及其产物的H PLC 图谱分析 从图5、6可以看出,GB E 经β-葡萄糖苷酶水解后产生了一系列新物质。