实验二培养基的配制和灭菌一、实验目的微生物的生长发育都有一定的营养需要，培养基即人工培养微生物、为其生长发育提供所需营养的基质。
培养基配好后必须经过灭菌方能用于分离培养微生物试验，因此培养基的配制和灭菌是植物病理实验室中最基本的工作，通过本次实验学习植病实验室中常用培养基的配制方法和高压灭菌锅的使用方法。
二、内容、材料和方法(一)培养基的配制培养基按组成成分及对这些成分了解的程度分为天然培养基、半组合培养基和组合培养基三类，从物理性质上又分为液体培养基和固体培养基两类，培养基的种类不同，配制方法也有差异，限于时间，本次实验仅配制马铃薯琼脂培养基和牛肉膏蛋白胨培养基。
1马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）这是植病实验室最常用的培养基(简称PSA)，主要用于植物病原真菌的分离和培养，有时也用于植物病原细菌。
成分：马铃薯200克蔗糖 10~20克琼脂 17~20克加水至1000毫升方法：将马铃薯洗净去皮切块，加水煮沸半小时，用双层纱布滤去薯块，补足水量，加入琼脂，加热熔化，再加糖，待完全化后，乘热用双层纱布过滤分装，塞好棉塞高压灭菌。
马铃薯蔗糖琼脂培养基略带酸性，培养真菌无需调节pH，培养细菌则调节pH至中性，此培养基留作下次实验分离培养病原真菌用，故不必调节pH。
5人分作一组，1、2组各作此培养基500毫升，其中200毫升分装试管，每管约10毫升，灭菌后摆成斜面；其余300毫升，分装在3个250—300毫升的三角瓶中，每瓶装100毫升左右，灭菌后妥善保存，留待下次实验使用。
2肉汁胨培养基（BPA）这种培养基主要用于细菌的分离和培养成分：牛肉浸膏 3克蛋白胨 5~10克蔗糖 10克酵母浸膏 1克琼脂 17~20克加水至 1000毫升方法：先将琼脂加热熔化于大部水中，再将其它各成分用少量水化开加入，调节pH至7，趁热用双层纱布过滤，分装，塞棉塞高压灭菌。
牛肉浸膏和酵母浸膏十分粘稠，不易称重，称重时用小烧杯盛装，以玻璃棒沾取，故要先称好杯和棒的重量后，再开始沾取浸膏称重，称后将杯和棒上粘着的浸膏洗净于锅中。
调节培养基pH至中性的方法如下：配成1N的HCl和NaOH，并另分别稀释配成1/20 N 的HCl和NaOH。
取培养基2毫升，加蒸馏水毫升，加指示剂溴百里酚蓝指示剂5滴，这时如培养基的测样呈黄色则用有刻度吸管加入1/20 N的NaOH若呈蓝色则加入1/2O N的HCl，使培养基最后呈草绿色即调节到中性，此刻所加酸或碱的毫升数的25倍即等于在1000毫升培养基中所需要加入lN 的NaOH或HCl的毫升数(注意这次是作500毫升培养基)，加蒸馏水稀释的目的防止调节过程中培养基凝固。
调节pH至中性的简便方法是用石蕊示纸。
也可以用多孔白色瓷板，在孔中加少量培养基和溴百里酚蓝或其它指示剂1—2滴，根据颜色反应，在所配的培养液中加入少量lN的NaOH或HCl，然后再取样测定，如此反复多次，达到所需求的反应为止。
5人分为一组，3、4两组各作此培养基500毫升，其中200毫升分装试管，每管约100毫升，灭菌后摆成斜面，其余300毫升分装在3个250—300毫升的三角瓶中，每瓶装100毫升左右，灭菌后妥善存放，留待下次实验使用。
此外，1、2、3、4各组均制备15管试管装和2瓶三角瓶装的无菌水。
(二)培养基的灭菌为了得到某种病原物的纯培养，配好的培养基必须经过灭菌才能使用，灭菌是指用物理或化学方法完全杀死器物表面及其内部的所有微生物，灭菌与消毒的概念不同，消毒则是指消灭器物或植物组织表面的某些微生物(能常称杂菌)，而不是消灭所有的微生物。
灭菌的方法很多，植病实验室常用的有干热灭菌和高压蒸汽灭菌两种方法，一般培养皿、吸管等玻璃仪器用干热灭菌法进行灭菌。
而培养基和实验用的土壤，则用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，具体灭菌方法和步骤如下：1干热灭菌法(1)将培养皿、吸管等玻璃器皿洗净干燥后，用旧报纸包好，或装入特制的铁筒中(每个吸管用纸包好后装入铁筒)，包纸时应将吸取的一端放在取时先折开的一端，以便取用时手勿触及要求灭菌的一端。
(2)将包装好的玻璃仪器摆入电热烘箱中，彼此间留有一定的空隙以便流通空气。
(3)关紧箱门，打开排气孔接上电源。
(4)待箱内空气排出到一定程度时，闭上排气孔，继续加热至一定温度后，用定温固定温度，灭菌温度一般165℃—175℃保持1小时即可。
(5)待自然降温冷却后(60℃以下)才能开门取出玻璃器皿，避免由于温度突然下降而引起玻璃器皿碎裂。
2高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法又称湿热灭菌，它的原理是利用高压来提高蒸汽的温度，达到灭菌的目的，其操作步骤如下：(1)关好排水阀门放入清水至标度为止，注意水量一定要加足，否则容易造成事故。
(2)将要灭菌的培养基、灭菌水等装入铁丝笼中，并用牛皮纸盖好后放入灭菌锅中，关上器盖，旋紧螺旋时，先将每个螺旋旋转到一定程度(不要太紧)，然后再旋紧相对的两个螺旋，以达到平衡旋紧，否则易造成漏气，达不到彻底灭菌的目的。
(3)通电加温，同时打开排气活门，排尽锅内的空气，即活门冲出的全部是蒸气时则表示彻底，此时可关闭排气活门，如果过早关闭活门，排气不彻底，也达不到彻底灭菌的目的。
通常当压力表指针升至5磅时，打开排气活门放气，降至零点，再关闭活门。
(4)压力表的指针上升时，锅内温度也逐渐升高，当压力表指针升至15磅时，蒸气温度相当于120℃—121℃(等于一个大气压)，此时开始计算灭菌时间，控制热源，使处于15磅压力保持30分钟，即能达到完全灭菌的目的，然后停止加温。
(5)稍微打开一点排气活门，使锅内蒸气缓慢排除，然后逐渐开大活门，气压徐徐下降，注意勿使排气过快，否则会使锅内的培养基沸腾而冲脱或沾湿棉花塞，但排气太慢又使培养基在锅内，受高温处理时间过长，这样对培养基也是不利的。
一般从排气到打开锅盖以10分钟左右为好。
(6)当压力表指针降到零、锅内蒸气完全排尽时，打开锅盖取出培养基，如需制备固体斜面培养基时，则应趁热将试管斜放在桌上，上面盖上报纸以免落灰尘，冷却后便可收起。
(7)最后将高压灭菌器内的剩余水排出。
(8)抽取上述灭菌的培养基，放入25℃温箱中，48小时后不见杂菌生出，便证明培养基已达到灭菌目的，可以使用。
此外，有些培养基在经高压灭菌后，其营养成分容易分解而失去使用价值，此时可采用间歇蒸气灭菌法，即将培养基放入高压灭菌器内，加热至100℃，保持1小时，每天灭菌一次，连续进行三次，即可达到灭菌的目的，又不至使营养物质分解。
三、思考题1培养基有哪几种类别各有什么特点和用途？2干热灭菌和高压蒸汽法适用范围如何电热烘箱和高压锅如何操作各有哪些使用注意事项？3怎样检查培养基灭菌是否彻底？关于微生物实验--培养基的配制和灭菌的思考题！急！2010-5-8 19:32提问者：喜欢和爱123|浏览次数：1520次1.在一般情况下为什么试管或三角瓶培养基要用棉花塞而不用软木塞或橡皮塞2.高压蒸汽灭菌过程中为什么一定要排放锅内的冷空气我来帮他解答2010-5-8 19:58满意回答1.棉花起到过滤、透气的作用啊！并且棉花的开头大小是可以尽可能改变的，而不需要非得找到合适的软木或橡皮塞！2.高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。
待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。
导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。
灭菌更彻底！常用培养基的制备、灭菌与消毒2006-09-20 00:00:00 来源：评论：0我要评论一、实验目的了解培养基的配制原理；掌握配制培养基的一般方法和步骤；了解常见灭菌、清毒基本原理及方法；掌握干热天菌、高压蒸汽灭菌及过滤除菌的操作方法。
二、实验原理培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。
培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。
根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。
由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供微生物生长繁殖之用。
干热天菌、高压蒸汽灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。
1.器材试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH度纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、吸管、培养皿、电烘箱、注射器、微孔滤膜过滤器、镊子等。
牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂四、实验内容1.称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→无菌检查2.干热灭菌：装入待灭菌物品→升温→恒温→降温→开箱取物3.高压蒸汽灭菌：加水→装物品→加盖→加热→排冷空气→加压→恒压→降压回零→排汽→取物→无菌检查4.过滤除菌：组装灭菌→连接→压滤→无菌检查→清洗灭菌五、关键步骤及注意事项1.要严格按配方配制。
2.调pH不要过头。
3.干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70ºC以下放物、取物。
4.高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零取物。
5.过滤除菌要注意各部件灭菌，压滤时，压力要适当，不可太猛太快，滤膜要注意清洗保存。
培养基的制备与灭菌录入时间:2011-7-11 14:15:04 来源：青岛海博在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。
灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系见表Ⅴ-4。
一般培养基用cm2，℃ 15-30分钟可达到彻底灭菌的目的。
灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。
例如含糖培养基用cm2(8磅/英寸2)，℃灭菌15分钟，但为了保证效果，可将其他成分先行℃，20分钟灭菌，然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶液。
又如盛于试管内的培养基以cm2，℃灭菌20分钟即可，而盛于大瓶内的培养基最好以cm2灭菌30分钟。
表Ⅴ-4灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系压力数全部空气排出时的温度(℃) 2/3空气排出时的温度(℃)l/2空气排出时的温度(℃)1/3空气排出时的温度(℃)空气全不排出时的温度(℃)千克(公斤/ 厘米2) (kg/cm 2)磅/英寸2(1b/in2)5101520253010010911512112613094105112118124128901001091151211267290100109115121蒸汽压力所用单位为kg/cm2(千克/厘米2)，它与1b/in2(磅/英寸2)和温度的换算关系见表Ⅴ-5。