（七）倒出、沥去最后一次清洗用水，开始进行植 物材料的切割及接种。 逐一取出经上述灭菌处理的植物材料，置于 下面垫有经灭菌处理的培养皿（或小白瓷碟）的无 菌纱布或滤纸上，左手拿小镊子，右手拿解剖刀， 切除各切段或切块上被灭菌剂毒坏的部分。如有必 要，也可再行切分。在完成切割后，将解剖刀和小 镊子在95%乙醇中浸蘸一下，在酒精灯焰上灼烧灭 菌之后放回原处，以便待冷却后下一切割再用。
实验三 外植体材料的预处 实验三 外植体材料的预处 消毒及接种 理、消毒及接种
一、实验目的： 实验目的： 熟悉外植体材料的预处理， 熟悉外植体材料的预处理，掌 握其消毒和接种方法。 握其消毒和接种方法。
二、方法步骤： 方法步骤： 酒精消毒→消毒剂消毒 预处理 →酒精消毒 消毒剂消毒 酒精消毒
（一）对采来的植物材料进行适当的预处理。除去 不需要的部分，将所需部分切割至适当大小，置自 来水龙头下流水冲洗几分钟至几小时，主要视植物 材料清洁程度而定。这在污染严重时特别有用。 （二）用洗衣粉水（1~2角匙洗衣粉/100 ml水）等 浸洗上述植物材料约5 min，再用自来水冲净洗衣粉 水。这是进一步减少污染的处理。 同时配制消毒液：50%次氯酸钠溶液。
（九） 在完成了该第一只培养容器的外植体接种操 作后，用70%乙醇对超净工作台的台面进行擦拭灭 菌，接着再进行第二只培养容器的外植体接种及超 净台台面的灭菌，直至全部完成。
作业：练习无菌操作；统计植物材料表 面灭菌结果；分析污染原因；、沥干水的植物 材料放入广口瓶或烧杯，向其中倒入新鲜配制、 浓度一定并且加有一定量（通常为灭菌剂消毒液 的0.5%，或每100 mL消毒液滴加10~15滴） Tween-80（土温-80）等表面活性剂的消毒液适量 （液面高度超出植物材料至少0.5 cm），开始计 算灭菌时间。也可在使用上述灭菌剂之前，先将 植物材料浸于70%乙醇灭菌10~30秒。
（三） 将接种用具、无菌水等从80℃烘箱中或直 接从高压灭菌器中取出，置于超净工作台上。打开 超净工作台中的紫外灯，在进行紫外线灭菌处理至 少30 min后关掉紫外灯。 （四） 操作人员洗手擦干，换上洁净工作服，戴 上帽子以免头发散落以及带来污染。坐到超净台前， 并将装有经湿热灭菌培养基的培养瓶、配好的消毒 液、洗净沥干的植物材料置于超净工作台上，用 70%酒精棉球擦手与器具外壁，即可对经上述预处 理的植物材料进行表面灭菌处理，自此以后各步均 须在超净工作台上操作。
实验一 MS培养基的配制和灭菌 实验一 MS培养基的配制和灭菌
一、实验目的： 实验目的： 学习、 学习 、 掌握植物组织固体 培养基的配制和灭菌方法。 培养基的配制和灭菌方法。 配制 方法
二、实验步骤： 实验步骤： 称量→混合 混合→调 值 灭菌 称量 混合 调pH值→灭菌
称量：按每瓶培养基终体积50mL计，称取适量的 称量： 琼脂粉（6g/L）和蔗糖（30g/L），置于2L大烧杯 中，加蒸馏水至需配培养基终体积的3/4左右，加 热使之溶解。 混合： 混合：分别加入一定量的贮备液I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和 生长调节物质及其它特殊补加物，再加蒸馏水直至 需配培养基的终体积。 调pH值：充分混合后，0.1mol/L的NaOH调节培养 pH值 基的pH值至5.8。 灭菌： 灭菌：封严培养容器口后，120℃灭菌20min后， 将培养基取出，置于水平台子上，在室温下冷却， 备用。
（六）在持续灭菌时间内定时用玻璃棒轻轻搅动， 以促进植物材料各部分与消毒液充分接触，驱除气 泡，使灭菌彻底。在灭菌时间结束前1 min时，即可 开始用玻璃棒等轻轻压住植物材料将消毒液慢慢倒 入废物缸，注意勿使植物材料滑出。接着立即倒入 适量无菌水，轻搅植物材料以清洗去除灭菌剂残留。 一般表面灭菌时间的计算是从倒入消毒液开始，到 倒入无菌水为止。无菌水的清洗时间每次约3 min； 清洗5次。
（八）接着，左手拿培养瓶，将培养容器口外壁在 靠近酒精灯外焰处转燎数秒，以将其可能带有的微 生物等固定于原处；在酒精灯焰附近处，用右手拇 指与食指配合将瓶塞打开，并将其夹于左手无名指 与最小指之间；再将培养瓶口在酒精灯焰上轻转灼 烧灭菌；以右手拇指与食指配合，用大镊子夹紧一 外植体准确送入培养容器，并将其轻轻地半插入固 体培养基；将大镊子在95%乙醇中浸蘸一下，在酒 精灯焰上灼烧灭菌之后放回原处，以便待冷却后下 一操作再用；将培养瓶口及瓶塞分别在酒精灯焰上 小心地轻转灼燎数秒；盖好瓶塞，旋紧，将其置于 超净工作台的适当位置。