苹果酸、柠檬酸含量的测定（HPLC法）
1）原理苹果酸、柠檬酸在酸性缓冲液中，利用反相键合色谱法将其从样品基质中分离出来，根据该类物质在紫外波长下的吸收进行定性和定量分析。

2）试剂1）溶剂：水，过滤后的二次蒸馏水
2）流动相：0.5%的H3PO4/KH2PO4缓冲液，PH=2.81, 含2.5%乙腈
3）苹果酸、柠檬酸标准品；纯度99.2%和99.5%
4）苹果酸、柠檬酸标准溶液
分别准确称取苹果酸、柠檬酸标准品0.2g 和0.02g ，精确至0.0001g，用过滤后的二次
蒸馏水将标准品溶解，转移、定容于50ml容量瓶中，混匀后贴标签备用。

5）苹果酸、柠檬酸标准工作溶液
分别将上述标准品贮备液以5倍和10倍比例稀释，得到三个不同浓度的系列，在给定的
色谱条件下，每一浓度样品进样三次，然后绘制出标准工作曲线。

标准溶液应避光，在0~4℃下贮存，标准液贮存期不超过二个月。

3）仪器所使用的玻璃仪器必须是洁净的。

3.1 液相色谱：
单元泵，可变波长检测器，化学工作站。

3.2 色谱柱：
ODS反相柱
150mm * 4.6mm(ID).5um填充颗粒。

3.3 进样器：20ul微量进样针
3.4 色谱条件：流动相：0.5%H3PO4/KH2PO4缓冲液（PH=2.81）；含0.025%乙腈。

流量：1.0ml/min
柱温：40℃
检测波长：206nm
进样量：5ul
保留时间：苹果酸2.5min；柠檬酸3.5min
以上条件是典型条件，可根据情况对给定参数作适当调整，以确保方法的稳定性和耐用
性。

4）测定步骤4.1样品溶液的制备
称取浓缩果汁 4.0~5.0g 或清汁10ml，精确至0.01g，用二次蒸馏水将其溶于50ML 容量瓶中，定容至刻度，混匀后，用0.45um滤膜的过滤器将其过滤至样品瓶中，贴上标签备用。

4.2 测定：在以上色谱条件下，运行仪器和测试方法，待基线稳定后，按照标准溶液、样品的顺序进样。

4.3计算
根据标准液绘制的标准曲线进行外标法定量，保留时间和响应因子均由标准液确定。

5）允许差两次平行测定结果之差，相对偏差≤10%。

网友评论：
1）这个方法，能将苹果酸跟水果中其他物质的杂峰分开吗？
2)我用此体系KH2PO4+甲醇，柠檬酸做的和配料表不一样，还没时间找原因？不过，感觉你的出峰快！
ODS为反相柱，流动相一般为甲醇、乙腈、水，等极性相对较大的物质，不可以用非极性物质做流动相，梯度洗脱时应从大水相开始，最后过渡到大有机相，实验结束后应用甲醇水或乙腈水冲洗，30-60min，如果实验中用到缓冲盐应用大水相冲洗60min以上，将盐替换出来，最后保存在85-95%的有机相中。

另外，色谱柱使用过程中不能碰撞、弯曲或强烈震动。

当柱子和色谱仪连结时，阀件或管路一定要清洗干净。

大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2 ～7.5，硅胶柱pH8时会发生硅胶溶脱，键合型柱p H<2时会发生键合相断裂，流动相尽量不超过色谱柱的p H范围。

普通C18柱尽量避免在4 0℃以上的温度下分析。

保护柱：最好使用预柱作为保护柱，减少污染物对分析柱的损伤。

压力升高通常是需要更换预柱的信号。

安装柱时，请注意流向，接口处不要留有空隙
反相柱（reversed phase column）：填料是非极性的，官能团为烷烃，例如：C18(ODS)、C8、C4等。

在反相柱中C18（Octadecylsilyl，简称ODS），即十八烷基硅烷键合硅胶填料，这种填料在反相色谱中发挥着极为重要的作用，它可完成高效液相色谱70～80％的分析任务。

由于C18(ODS)是长链烷基键合相，有较高的碳含量和更好的疏水性，对各种类型的生物大分子有更强的适应能力，因此在生物化学分析工作中应用的最为广泛，近年来，为适应氨基酸、小肽等生物分子的分析任务，又发展了CH、C3、C4等短链烷基键合相和大孔硅胶（20～40μm）。

色谱柱的分类
1.根据所有的担体材料分为三种：
(1)硅胶型：机械强度高，易制成小颗粒，理论塔板数高。

(2)聚合物型：在广泛的PH值范围内稳定。

(3)羟基磷灰石型：对蛋白质等生物高分子样品有特殊的选择性。

2.根据分离方式分为：
(1)正相：SIL--磷脂、NH--糖、维生素E，CN--甾类激素。

(2)反相：ODS(C18)、(C8 CN TMS Pheny1)低分子量化合物。

(3)离子交换等。