仅仅研究于生命科学，不适合在诊断过程使用只能在体外使用地高辛DNA标记和检测试剂盒1和NBT/BCIP一起用于颜色检测通过酶联免疫法采用地高辛-dUTP进行随机引物DNA标记，碱性标记和检测货号：11 745 832 910此试剂盒储存条件-15o C—-25o C此试剂盒可对10ng-3ugDNA进行12次标记反应可检测100cm2面积的杂交膜24张指导手册2009.11版1前言1.1内容表1前言 (2)1.1内容表 (2)1.2试剂盒内容 (3)2简介 (5)2.1产品概述 (5)3步骤和所需材料 (8)3.1开始之前 (8)3.2地高辛DNA标记 (9)3.3 标记效率的测定 (11)3.4 DNA 的转移和固定 (14)3.5杂交 (16)3.6免疫检测 (18)3.7 DNA印记的洗脱和再杂交 (20)4结果 (21)4.1典型的结果 (21)5附录 (23)5.1故障排除 (23)5.2引用 (24)5.3订购信息 (25)1.2 试剂盒内容附加仪器与所需试剂除了上表中列出的试剂外，你必须准备一些溶液。

在下表中，你可以找到不同操作程序需要准备的设备概要。

*标记的产品可以从Roche Applied Science 获得2 介绍2.1 产品概况实验原则此试剂盒采用地高辛（DIG），一种甾类半抗原，去标记DNA探针从而通过酶免疫分析应用地高辛标记DNA探针可以用于：所有类型的滤膜杂交总基因组DNA中单拷贝基因的检测，甚至对于高度复杂的生物也可以进行检测，如人，大麦和小麦。

样品材料至少100bp的DNA片段线性的质粒，cos质粒或者λDNA超螺旋的DNA实验时间此表格列出了每一步实验所需的反应时间检测数量一个试剂盒足够用于：不超过3ug的模板DNA的12个标准的标记反应和100cm2有24个斑点的检测质量控制根据操作步骤中的描述，对未标记的对照品DNA（PBR328）进行标记，0.1pg同源DNA 在点杂交中通过16h的显色来检测（1pg同源DNA可以通过1小时的显色进行检测）。

试剂盒的储存和稳定性未开封的试剂盒在保质期内可以稳定的存放在-15o C到-25o C（保质期印在标签上）。

在干冰中运输一旦开封，请根据下表达选择适宜的储存条件。

灵敏度和特异性采用southern 杂交从1ug消化胎盘DNA中检测到单拷贝人基因注意：灵敏度同时依据在杂交中标记的DNA浓度和颜色反应的时间优点此表描述了这个试剂盒的优点和特征3 实验步骤和所需材料3.1 在你开始前主要的操作要求此表中描述了地高辛标记和检测中主要的提示流程图3.2 地高辛标记DNA介绍随机引物标记的DNA带有地高辛--11--dUTP，这一标记采用的是地高辛高效引物试剂，这是一种含有随机六碳糖，5乘浓度标记的混合物，其中，dNTP混合物包括碱性标记的地高辛--11--dUTP，标记级的Klenow酶和适合的反应缓冲液。

附加设备和所需试剂水浴冰水混合物模板DNA标记从琼脂糖凝胶上分离的DNA如果你想要完成基因组的southern 杂交，你应该利用琼脂糖凝胶电泳将插入载体的模板DNA从载体上分离出来。

从凝胶中分离DNA片段，为获得更好的结果，可以用高效的PCR产物纯化试剂盒或者用琼脂糖凝胶DNA提取试剂盒来从凝胶中分离DNA。

步骤此步骤用于标记10ng-3μg DNA 。

可以通过扩大所有成分和体积标记更大量的DNA（最高达10μg）。

标记反应的产量表1：此表向您展示了在适宜条件下地高辛高效引物标记的产量。

在标准反应中每个实验采用1μg DNA 作为模板。

1小时内，大约有15%的核苷酸参与到了0.8μg新合成的地高辛标记DNA中。

20小时后消耗了大约38%约2μg的核苷酸。

使用地高辛高效引物溶液，增加不同模板DNA的量进行反应，并检测反应1小时和反应20小时的差异。

地高辛标记DNA的产量由放射线示踪器进行测定，并通过斑点杂交进行证实（10个独立标记实验的平均值）。

3.4 标记效率的确定介绍地高辛标记DNA产量的确定对于获得最佳的，具有可重现性的杂交结果十分重要。

在杂交混合物中探针浓度过高容易产生背景，而太低浓度则容易导致信号弱。

实验原则检测标记探针质量的好方法是直接检测法。

所需附加溶液的制备请找出下表中的成分和所需制备的试剂。

下表中的缓冲液也可以在地高辛洗涤和封阻缓冲液，DNA酶和RNA酶系列产品中获得。

请注意：这些溶液也用于3.6中的检测步骤，可大批量准备试剂盒工作溶液的制备下表中列出试剂盒工作溶液的制备方法：稀释系列根据合成核苷酸的预期产量开始下面的的系列稀释，标记的探针和地高辛标记的对照DNA（Vial 2）应该稀释到1ng/μL。

利用第3.2章中图表1可以最好的估计出在你的探针中地高辛标记DNA的预期产量。

产量取决于起始时的模板量和孵育时间。

注意：表1中给出的产量是采用高纯度的DNA模板在最佳条件下生产出的。

操作步骤下面的步骤描述的是直接检测。

注意：在全部的步骤中，用足够的缓冲液体积完全覆盖膜。

结果分析比较对照与你的标记反应产生的点的强度差异，并计算出地高辛标记DNA的量。

如果你的探针稀释后量达0.1pg的点与对照DNA的点均可见，那么说明标记的探针达到了预期的标记效率，能够满足杂交所需的探针浓度。

3.4 DNA的转移和固定转移方法和膜凝胶电泳的标准操作方法，胶的变性和中和均参照参考文献中Sambrook等的文章。

胶中不加入EB会更好，因为EB可能引起背景不均匀的问题。

所有普通类型的DNA转移方法都适用于后续的地高辛杂交实验（4,5）；在实验中，在20×SSC中采用毛细管转移的方法将DNA转移到带有正电荷的尼龙膜上可以获得最好的结果。

注意：碱性转移（如在0.4M NaOH中）不适用于地高辛分子量的标记的转移。

固定操作将DNA固定到膜上可以通过下面的任何一种操作：膜的储存请根据下表选择膜的储存方法。

3.5 杂交需要的附加设备冰水浴震荡水浴或杂交炉耐高温的塑料或者玻璃盒，培养皿，滚筒瓶或者可密封的塑料袋注意：不要用敞口的容器盛放地高辛杂交缓冲液杂交工作溶液的制备分两次小心的将64ml无菌双蒸水加入地高辛杂交颗粒（7号瓶）中，然后，立即在37o C 条件下搅拌5分钟进行溶解。

杂交温度适宜的杂交温度是根据GC含量和探针与靶片段的相似百分数计算获得的，具体的公式如下：Tm =49.82+0.41(%G+C)-(600/I) {I=能够杂交上的片段的长度，以碱基对进行计算}T opt.= Tm -（20～25℃）这一给出数字的方程式是根据杂交溶液中含有50%甲酰胺的标准方程式计算得到的。

用于地高辛杂交液进行杂交的实际杂交温度T opt.要比计算出的Tm低20-25℃。

T opt.可以作为一个严谨的杂交温度，允许探针和靶序列之间有18%的错配。

当你的探针与靶序列的相似度低于80%时，你应该相应的降低T opt（大约每1%的错配要降低1.4℃），同时相应的调整严谨洗涤步骤（即提高SSC浓度和降低洗涤温度）。

操作步骤请参照下表进行实验。

杂交液的储存含有地高辛标记探针的地高辛杂交液可以储存在-15到-25℃，可以反复使用几次，在每次使用前需要68℃新鲜变性10分钟。

注意：不可以将杂交液煮沸。

严谨洗涤对于大部分DNA:DNA应用,用0.5×SSC进行严谨洗涤已经足够。

针对每个探针来说，正确的洗涤条件应该依据经验来确定。

对于人基因组DNA，采用的条件是0.5×SSC，65℃。

探针长度大于150bp且GC含量高时，应在68℃下进行洗涤。

对于长度为100bp或更短的探针，洗涤温度应该降低。

此表描述了怎样完成后面的杂交洗涤。

3.6 免疫检测需要附加的试剂请找出下表中的成分和所需制备的试剂。

下表中的缓冲液也可以在地高辛洗涤和封阻缓冲液，DNA酶和RNA酶系列产品中获得。

试剂盒工作溶液的制备下表中列出试剂盒工作溶液的制备方法：操作步骤此表描述了完成一张100cm2膜的免疫检测方法。

注意：所有的孵育均是在15-25℃下，振荡完成的。

如果膜还需要再次与探针杂交，那么任何时候都不要让膜干。

3.7 DNA印记的洗脱和再次探针杂交主要信息印记中的碱性标记形式的DIG-11-dUTP 能够更容易更有效的被洗脱，以用于再一次的杂交实验。

所需附加的仪器和试剂DMF2×SSC0.2N NaOH, 0.1% SDS操作步骤此操作描述的是膜的洗脱。

注意：如果计划印记需要洗脱和再次杂交，那么膜在任何时候都不能干。

可选择的洗脱方法，用于filter杂交的地高辛应用操作手册中提到的（可以通互联网获得）洗脱后的膜需要的储存条件一旦膜被洗脱，可以将膜放在马来酸缓冲液中或者2×SSC中准备再用。

4 结果5 附录21。