蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。
发展简史
1969年，美国耶鲁大学Gall和Pardue首先创立，用 爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交， 确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。
1971年， Jacob 创立电镜原位杂交技术检测爪 蟾卵母细胞DNA
基本概念
核酸原位杂交技术：利用放射性或非放射性标记的已知核酸探针， 通过放射自显影或非放射检测系统检测组织、细胞及染色体上特 异DNA或RNA序列的一种技术，
一种直接、简便的研究基因定位和表达的方法
杂交双方：待测核酸序列、核酸探针
待测核酸序列：克隆的基因片段，未克隆化的基因组DNA和细胞 总RNA。
应用原位杂交技术，可在原位研究细胞合成某种多肽或蛋白 质的基因表达。
此方法有很高的敏感性和特异性，可进一步从分子水平来探 讨细胞的功能表达及其调节机制。
原位杂交的基本原理
在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知的 RNA核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测 细胞或组织中相应的基因片段相结合（杂交），所形成 杂交体 (Hybrids）经显色反应后在光学显微镜或电子显 微镜下观察其细胞内相应的mRNA、rRNA和tRNA分子。
DNA/RN用于基因组DNA的定性定量分析、酶切图谱分析、基因 突变分析及限制性片段长度多态性分析（RFLP）等。
RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。靶核酸是RNA；电泳时，
凝胶中加入变性剂，防止RNA分子形成二级结构
核酸探针：用放射性同位素、非放射性荧光染料直接或间接标记 的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片 段。
分为cDNA探针、基因组DNA探针、寡核苷酸探针、RNA探针
分子杂交
分子杂交(简称杂交,hybridization) 就是应用核酸分子的变性和复性的性 质,使来源不同的DNA(或RNA)片段,按碱基互补关系形成杂交双链分子。
1. 定义、基本概念和发展简史 2. 原位杂交的基本原理 3. 探针 (probe)与探针的标记物 4. 探针标记法与探针的纯化 5. 探针制备技术 6. 核酸分子杂交信号的检测 7. 地高辛标记寡核苷酸探针的原位杂交方法
定义
原位杂交组织化学（ISHH）简称原位杂交 是将分子杂交与组织化学相结合的一项技术 在原位检测组织、细胞中的特定核酸序列
• 标记碱性磷酸酶—抗碱性磷酸酶显色 • 优点：完全、方便、省时，敏感性和质
量控制较好，可检测人基因组DNA的单拷 贝基因，背景反差好。
发展简史
• 1991年 Couton建立将非放射性标记技 术更新为亲和复合物标记技术 （ Affinity-complex Labelled Probes ， ACLP）。
80年代，原位杂交技术飞速发展 现已能检测只有数百碱基对的较小分子 DNA和含量很低的mRNA
当时的工作多采用冰冻组织切片或培养细胞，探 针均采用同位素标记。
同位素标记缺点：污染环境，有害人体，半衰期局 限性
发展简史
• 1981，Bauman等首先应用荧光素标记cRNA探 针做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成 功——荧光杂交技术。
• 生物素标记探针技术目前已被广泛应 用——酶促生物素标记技术
发展简史
1987年 Pezzella用磺基化DNA探针，以单克隆 抗体识别磺基化探针，通过免疫组化显示结合 的单克隆抗体，对杂交结合探针定位。
• 优点：探针标记简便，不需作切片平移标记， 敏感度较高。
发展简史
• 1987年，将地高辛标记的有关试剂及药 盒投放市场。地高辛标记技术引起科技 工作者的极大兴趣。
• 发展趋势：实验室常规技术和临床日常 应用的诊断技术。
原位杂交的基本原理
以DNA分子复制原理为基础。
两条核苷酸单链片段，在适宜的条件下，通过氢键结合，形 成DNA-DNA、DNA-RNA或 RNA-RNA 双键分子，应用带有 标记的（放射性同位素，如3H、35S、32P，荧光素生物素、 地高辛等非放射性物质）DNA或RNA片段作为核酸探针，与 组织切片或细胞内待测核酸（RNA或DNA）片段进行杂交， 然后可用放射自显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观察 目的 mRNA或DNA 的存在并定位；
原位杂交
将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交， 从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。
探针
是指带有某些标记物(如放射性同位素32P，异硫氰酸荧光素等)的特异性 核酸序列片段。设法使一个核酸序列带上32P，那么它与靶序列互补形成 的杂交双链，就会带有放射性。
核酸分子杂交：按照碱基互补配对原则，将不同来源的 序列互补单链的DNA/DNA，RNA/RNA，RNA/DNA，互补配 对成双链杂交分子，这一过程叫核酸分子杂交。
原位杂交：用核苷酸探针对特殊的核苷酸顺序在其原位进行 杂交,叫原位杂交。可用于DNA、RNA定位研究。
反义技术
主要是引入目的基因mRNA 的反义序列或与目的基因 互补配对的反义基因，通 过它们的杂交而阻遏或降 低目的基因表达的一种方 法。当引入的反义核酸与 相应序列互补配对后，用 于表达目的基因的mRNA量 大大减少，使细胞中靶基 因编码的蛋白合成量也大 为减少
背景
核酸mRNA、DNA
RT-PCR Realtime PCR
Northern blot （RNA） Southern blot（DNA） 原位杂交 指纹分析（Finger printing） 基因芯片（ DNA microarray）
蛋白质
ELISA Westhern blot 免疫组化
主要内容
• 1982，Shroyer报道用2，4二硝基苯甲醛（DNP） 标记DNA探针，使该DNA探针具有抗原性，然后用 兔抗DNP的抗体来识别杂交后的探针，最后经免疫 过氧化物酶的方法来定位杂交探针
• 上述两种方法敏感度不高，应用不够普遍。
发展简史
• 生物素标记探针技术是Brigat（1983） 首先建立的，它利用生物素标记的探针 在组织切片上检测了病毒DNA，通过生物 素与抗生物素结合，过氧化物酶-抗过氧 化物酶显示系统显示病毒DNA在细胞中的 定位。