A novel nucleophilic catalytic mechanism for nattokinase. J Mol Graph Model 23(4):373–380
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纳豆激酶作用机理
纳豆激酶
纤溶酶原激活物抑制剂
纤维蛋白
纤溶酶原激活物
纤溶酶
内源性尿激酶 纤维蛋白降解
尿激酶
纤溶酶原
纳豆激酶ＮＫ 可以直接激活纤溶酶原（ Pg ）产生纤溶酶（Pm）从而 降解血栓，也可直接对纤维蛋白进行降解，是研究较早且较完善的天然溶栓酶
纳豆激酶生产
2、植物分子农业（PMF）
利用植物系统产生人类药用重组蛋白
烟叶
优 点 通过黄豆矮病毒（BeYDV）
的DNA复制系统
缺
点
1、NK被细胞壁包被，经胃肠道时被保护
口服给药；经消化系统消耗 克服 时不会诱导免疫原性反应 手段
1、纳豆激酶被蛋白糖基化，患者注射 产生副作用：免疫原性
在植物种子中表达重组蛋白
活性提性高得两到倍提高
纳豆激酶几个保守的氨基酸序列被认为是其活性的主要决定因素，因此可以通过 定点诱变，提高纳豆激酶的稳定性，如对pH和温度的稳定性，催化活性和抗氧化活性。
17 Cai D1, Zhu C1, Chen S2. Microbial production of nattokinase: current progress, challenge and prospect.World J Microbiol Biotechnol. 2017 May;33(5):84
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整体来说存在 半衰期短、
成本高等问题
第一代溶栓药物
传统溶 栓药物
第二代溶栓药物
降解纤维蛋白同时也降解纤 维蛋白原，易致全身纤溶， 安全性较差。
与纤维蛋白原亲和力低， 高的纤维蛋白选择活性
半衰期短，短时间内需 大量用药，且价格昂贵， 有一定的出血副反应
第三代溶栓药物
快速，特异性强，安全性 高，是当前溶栓药物的主体
血小板
红细胞 凝血因子
凝血因子与抗凝血因子平衡打破 纤维蛋白单体聚合形成多聚体 产生血栓的核心基质
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传统溶栓药物
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溶栓药物的作用机理
传统药物
新型药物
溶栓药物主要依靠溶栓系统机制进行血栓的降解， 传统溶栓药物主要依靠激活纤溶酶原产生纤溶酶通路进行血栓降解，
新一代的溶栓药物则直接或间接作用于纤维蛋白（Pm）。
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纳豆激酶生产
1、基因工程重组生产纳豆激酶
1
大肠杆菌
产生
不溶且非活性包涵体 （重组NK蛋白聚集体）
存在的问题
提取纯化困难
改 进
中国大肠杆菌
分离出NK基因，与周质分泌信号、PeLB、天然NK信号肽结合
NK活性低
2
枯草芽孢杆菌
启动子(TACAAT)—10元件被共 有的—10区（TATAAT）替换
NK表达增加
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新型天然溶栓酶
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新型天然溶栓酶
纳豆激酶（NK） 蚯激酶（LK） 单环刺螠溶栓酶 吸血蝙蝠唾液溶栓酶原激活剂
纳豆激酶优点： 与其他纤维蛋白溶解酶（如尿激酶，第一代溶栓药物）相比，具有无副作用， 成本低，寿命长的优点，是一种有潜力的治疗心血管疾病的药物。
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纳豆激酶结构
Ser-His-Asp催化 三联体，是纳豆激 酶催化活性的中心
克服 手段
2、纳豆激酶必须及时收取; 否则会受 到蛋白水解
在食用植物中生产，未加 克服 工的植物材料作为重组蛋 手段
白口服递送药剂
3、纳豆激酶的下游加工和纯化昂贵
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纳豆激酶提取分离
传统的提取分离方法
有机溶剂分馏，盐析和蛋白质亲和层析等
存在的问题
蛋白质回收率低和操作复杂
目前发现的优化策略
1、通过使用膨胀床方法，从枯草芽孢杆菌发酵液中纯化95% 的纳豆激酶与传统方法相比，产率提高50%
纳豆激酶由275个氨基酸组成， 分子量为27.7kDa，pI为8.6。 纳豆激酶在pH5.5〜9.0时显示 出相当大的活性。 强碱破坏其功能和结构稳定性， 当温度超出60℃其活性降低
Zheng ZL, Zuo ZY, Liu ZG, Tsai KC, Liu AF, Zou GL (2005) Construction of a 3D model of nattokinase, a novel fibrinolytic enzyme from Bacillus natto.
Weng Y, Yao J, Sparks S,Wang KY. Nattokinase: An Oral Antithrombotic Agent for the Prevention of Cardiovascular Disease. Arráez-Román D,
ed.International Journaof Molecular Sciences. 2017;18(3):523.
改 进
细胞外蛋白 酶缺陷型枯 草芽孢杆菌
acoA启动子的控制
高产
会同时产生水 解NK的天然的 细胞外蛋白酶
不适合大规模 的工业生产
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纳豆激酶生产 1、基因工程重组生产纳豆激酶
——基因重组提高纳豆激酶产量
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Cai D1, Zhu C1, Chen S2. Microbial production of nattokinase: current progress, challenge and prospect.World J Microbiol Biotechnol. 2017 May;33(5):84
2、使用一种新型的混合模式吸附剂（ fastline PRO ）其通过 分析pH和离子浓度，被用于膨胀床反应器中，提高吸附剂的 吸附能力
3、使用三项分配（TPP）从发酵液中纯化纳豆激酶
4、通过结合微滤和超滤，提高回收率和纯度。
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纳豆激酶优化
在10优1位化丝22氨0位酸的引苏入氨酸 大侧和链2，22I位31的L突甲变硫菌氨酸 株中纳纳豆豆激激酶酶的的抗催氧化化活
关于一ห้องสมุดไป่ตู้新型溶栓酶——纳豆激酶的简介
组员：王璇、石硕、张艳红、钟晓丽
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目 录
壹 背景介绍 贰 传统溶栓药物 叁 新型天然溶栓酶 肆 参考文献
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背景介绍
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血管栓塞类疾病现状
全世界每年约有2600万人因血 栓类疾病死亡， 我国心脑血管疾病死亡人数占 因病死亡总人数的40.7%，居死 因之首。
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血栓形成机制
纳豆激酶的挑战与前景
挑战
1、虽然通过基因工程和蛋白质工程等提高了纳豆激酶的产量和酶活性的优化，但在此方面 仍需进一步优化，才能满足生产需求。 2、虽然通过定点诱变进行了许多科学的尝试，但是温度，pH和氧化敏感性已经阻碍了纳豆 激酶的产生和应用。 3、 提取和纯化过程限制了纳豆激酶的工业生产，即使遗传修饰的菌株具有强大的产生纳 豆激酶的能力。因此需要开发新的分离提取工艺，以提高纳豆激酶的产率、活性和稳定性