Cre重组酶催化位点：loxP位点
当基因组含有一个重组酶识别位点时，转入基因可以
发生位点特异性整合，但必须解决整合的稳定性问题 loxp 位点的点突变 ：突变点
Cre酶无法有效识别
降低基因丢失几率
：突变点
loxp 位点的点突变
Cre酶无法有效识别
实现稳定的基因颠倒
或者采用类似于λred系统的策略，重组酶基因在温敏性辅助质粒上诱导表达
marker
gene A gene A
marker
tag sequence loxP/FRT sequence C terminal sequence (no translation stop signal )
molecular cloning free
A single chromosomal FRT site becomes the substrate for recombination with FRT-containing replication-deficient plasmids that carries lacZ and lacY, designed in such a way to create either a transcriptional or translational fusion to the promoter of interest.
Programming cells by multiplex genome engineering and accelerated evolution Nature 460, 894-898
IV 染色体大片段复制
2
marker
marker
复制染色体上的基因：加入PCR产物，引物设计时上游引物与目标基因下 游序列同源，下游引物与目标基因上游序列同源，第一次重组造成染色体 断裂，第二次重组一条染色体修复，并造成目标基因多一个拷贝。 引物设计时加入同向排列的特异性位点，可弹出MARKER 应用该技术可复制长达1Mbp的序列。
λ 噬菌体 P O P’
包装
感染宿主
P O P’ × B O B’ Int Int IHF IHF Xis P O B’
B O P’
λ 噬菌体的整合和切离
两边为13bp反向重复序列，中间位8bp非对称核心序列
（1） 重组机理

loxP loxP
loxP
loxP

如果一个DNA分子上 两个特异位点之间发 生重组，其后果有两 种可能性：两个位点 之间的片段或丢失， 或被颠倒 生物能够利用这种重 组倒臵来控制基因的 表达因为DNA的一正 一倒两种排列法可以 相应地表达两种不同 的蛋白质，细胞就可 根据需要作出选择。
2. 位点特异性重组系统及其应用
位点特异性重组
重组发生在特殊位点上，此位点含有短的同源序列,供重组蛋白识别。
位点特异性重组与同源重组的区别
重组位点限制： 有
同源序列的长短：短 重组酶的专一性：有 重组效率： 高达100%
常见的位点特异性重组系统
λ噬菌体系统：λ噬菌体编码λ整合酶（integrase，Int 重组酶，不可逆 ）、 来自E.coli的整合作用宿主因子（IHF，integration host factor）、切除酶 （excisionase ） P1噬菌体系统: Cre重组酶（可逆） 2 m质粒系统：FLP重组酶（可逆） 链霉菌噬菌体 C31系统 （不可逆） 均可广泛应用于真核细胞中
细菌的同源重组频率较低，且需要较长的同源区段.
E. coli 自身的同源重组系统主要包括： RecBCD, RecE, RecF系统，其重组效率均较低，且对同源区要求为：1–2 kb。 最主要的重组系统RecBCD在 dsDNA 同源区为 50–100 kb ( 通过接合转移和转导) ，才能高效重组。经修饰过的 RecBCD及 RecA 系统能在 Chi 位点 (crossover hotspot instigator, GCTGGTGG)高效重组，同源区段长度一般不 低于5kb，重组需要DNA片段两端有同向的CHI位点。如果 人工构建这样的片段， 其重组几率为10-5
λRed/ET recombination systems are highlighted by their ability to cross PCR-generated substrates bearing small regions of homology to the target gene (40–50 bp) into bacterial chromosomes, allowing bacterial geneticists to perform PCR-mediated gene replacement
转化PCR片段，培养2h后涂布抗性平板，高温培养
II 结合反向筛选进行基因替换
正向筛选：含有标记基因的克隆在筛选平板上长出，不含标记基因则死亡。 反向筛选：也称为负筛选，含有标记基因的克隆死亡，不含标记基因的克 隆正常生长
例：cat正筛选标记，sacB负筛选标记
cat sacB gene A
Medium
Step 1
cat
sacB
chloramphenicol
gene A Mutant
Step 2
cat
sacB
gene A Mutant
基因 敲除
sucrose
重叠延伸PCR
Gene inversion（small fragment)
cat
gene A
sacB
Step 1
cat sacB
gene A
第11章 基因工程新技术
1.λ Red 和 RecET 重组系统及其应用 2. 位点特异性重组系统及其应用 3. 基因打靶 4. 基因抑制技术
1.λ Red 和 RecET 重组系统及其应用
早在1990s, 研究者发现在酿酒酵母等真菌中具有高效的同源
重组系统，仅需要20~40bp长的同源区即可发生重组。可以 方便的利用 PCR产物进行基因打靶或替换。
MMR (specifcally remove the oligodirected base change)系统缺陷株中，重组效 率会提高2个数量级，可高达25%！这意味着 不再需要标记基因，可以进行数个碱基的替 换、插入或缺失。
mutS:Methyl-directed Mismatch Repair
位点特异性重组
例：植物中染色体大片段的缺失
gusA： 编码β-葡(萄)糖 苷酸酶，报告基因 Ds:植物转座子
marker1 FRT/loxP
marker2 FRT/loxP
marker1
marker2
染色体大片段颠倒：两个特异性位点反向排列，重组酶表达后，部分细胞 的两个位点之间序列颠倒。 基因融合


λ Red 系统的重组效率约比 RecET系统高3倍。
(2) 主要应用
需要辅助质粒，上面带有诱导表达的重组系统。为避免本底 表达对细胞的影响（毒性、诱变等效应），辅助质粒多为温 敏性质粒，可在高温下被消除。
I 基因敲除及markerfree操作（需结合位点特异性重组技术）
PCR产物扩增
诱导培养含pKD46大肠杆菌
（2）主要应用
I 利用位点特异性重组控制转入基因的表达
loxP loxP
将一个序列臵于目标基因与其启动子之间（如转录终止单元＋loxP序列） 阻遏基因的表达 将e基因臵于诱导启动子控制之下，控制Cre 重组酶的表达，从而控制 目标基因的表达
II 条件缺失突变体的构建
在目标基因的两侧引入特异性重组位点 将cre基因臵于诱导启动子或具有组织特异性的启动子控
(1) λ Red 系统 及 rac 噬菌体的 RecET系统的原理 ★
Red 系统包括3个基因: exo, bet 和 gam

exo 基因编码λ 核酸外切酶，其活性形式是一种环状三聚物分子, 中间有一中空的通道,通道的一端可容纳双链DNA 分子, 另一端 只可容纳单链DNA 。Exo 蛋白可结合在双链DNA 的末端,从DNA 双链的5′端向3′端降解DNA ,产生3′突出端。(RecE) Beta 蛋白是一种退火蛋白, 自发地形成环状结构(12–18 subunits per ring),,紧紧地结合在单链DNA3′突出端,防止DNA 被单链核酸 酶降解,同时介导互补单链DNA 的退火 ,双链DNA退火完成 后,Beta 蛋白从DNA 双链上解离下来。Beta 蛋白在Red 同源重组 过程中起着决定性的作 (RecT) Gam 蛋白可与RecBCD 结合,抑制其核酸外切酶活性，防止对外 源DNA 的降解 。宿主菌用recBCD缺陷株有利于该系统的高效重 组。
启动子+完整orfA: 复制 orfA的5’端或中间区域：失活
orfA的3‘端区域：对基因A表 达无影响，在染色体上多了一 个不完整的orfA拷贝（缺5’端）
制之下，在某种条件下使Cre 重组酶表达，从而缺失目标 基因
优点：同源重组造成“完全的”基因敲除，而同源重组和位点特异性 重组结合后可以对基因敲除进行时间和空间上的控制，例如 可以研 究致死型基因在特殊发育阶段的效应、研究基因是否在某种组织中表 达。
要避免Cre 重组酶的背景活性
III 利用位点特异性重组进行染色体工程
marker FRT/loxP FRT/loxP marker1 FRT/loxP
marker FRT/loxP
marker2 FRT/loxP
FRT/loxP
大肠杆菌中采用该方式一次性 删除117- 165-kbp片段，效率 100%
Marker free操作，但不属于无痕 操作，每次重组留下一个疤痕， 造成极性效应，多影响下游基因 表达。多个疤痕对后续操作也有 不利影响