发酵豆粕检测方法（参考）目录1.检测用仪器简介 (2)2.变性聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳 (3)3.Elisa 大豆球蛋白（酶联免疫法） (6)4.小肽的检测（酸溶蛋白） (10)5.寡糖的检测——薄板层析法（TLC） (11)6.乳酸的检测 (12)7.蛋白溶解度的检测（PS） (13)8.发酵豆粕蛋白溶解度的检测（改良） (14)9.水溶性蛋白的检测 (15)10.挥发性盐基氮（VBN） (17)11.PH 值测定 (19)12.水苏糖含量的测定 (20)13.水分、粗蛋白、粗灰分、粗纤维、尿素酶活性的检测 (20)1、检测用仪器简介2、变性聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE ）电泳聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE ）是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速而且可重复的方法。

通过对电泳条带的观察和分析，可以很明显的看出发酵前后或不同产品的抗原蛋白含量。

一、 原理SDS —聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE ）电泳主要依据蛋白质的分子量对豆粕中的抗原蛋白进行分离。

SDS 与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折迭结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。

SDS —蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。

由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。

SDS —PAGE 因易于操作和用途广泛， 成为许多研究领域中一种重要的分析技术。

二、 仪器 1、电泳仪及电泳槽 2、振荡器3、离心机（10000 转）4、移液枪（大、中、小）5、离心管（7ml 、5ml 或 1.5ml 、1ml ）三、 试剂： 1、单体母液： 100ml 丙烯酰胺（ACR ） 30g 甲叉双丙烯酰胺 0.8g去离子水定容至 100ml ，棕色瓶 4℃下存放。

可保存 3 个月。

2、分离胶缓冲液（（PH=8.8） 100mlTris-base （1.5mol/L ） 18.17gSDS 0.4g 浓 HCL 调节 PH 至 8.8，定容至 100ml ，过滤，4℃存放。

3、浓缩胶缓冲SDS 0.4g 浓 HCL 调节 PH 至 6.8，定容至 100ml ，过滤，4℃存放。

4、10%（w/v ）过硫酸铵 1ml 过硫酸铵 0.1g去离子水1ml4℃密封存放，可保存 7 天。

电泳缓冲液1000mlTris-base 3.02g甘氨酸18.8gSDS 1g蒸馏水溶解定容。

6、样品缓冲液储液（2×）50ml浓缩胶缓冲液（4×）25mlSDS（固体干粉）2g甘油10ml溴酚兰20mgβ-巯基乙醇 2.5ml加去离子水溶解，-20℃保存。

7、染色液1000ml考马斯亮蓝R-250 2.5g乙醇454ml冰醋酸92ml蒸馏水454ml8、固定液1000ml甲醇450ml冰乙酸100ml蒸馏水450ml9、脱色液1000ml乙醇456ml冰乙酸72ml蒸馏水472ml10、蛋白抽提液（PH=8.0）1000mlTris-base 3.64gβ-巯基乙醇0.7ml浓 HCL 调节 PH 至 8.0，定容至 1000ml，4℃存放。

四、待测固体样品处理粉碎待测样品，过 80 目筛，分析天平精确称量 1.000g，用蛋白抽提液浸泡，料水比为 1:30，摇床中 160rpm、22℃震荡抽提 3h，8000rpm 离心 15min。

取上清液保存。

短期4℃，长期-20℃保存。

五、电泳过程1、密封：将胶板上好并安装在电泳槽中，注意电泳槽底面与侧面卡紧，以免漏液。

2、制样：取蛋白样品10μl，与相同体积的加样缓冲液混匀，沸水浴 5min，冷却后备用（4℃保。

存）3、制胶：分离胶的配制胶浓度18%单体母液（ml）7.2去离子水（ml） 1.8分离胶缓冲液（ml） 3.010%APS（μl）60TEMED（μl）20共配制 12ml 胶液，合适本实验双槽式电泳槽两板胶用量。

将胶液沿着玻璃板倒入两板之间的夹缝至离上板口 1.50cm 处，加入1ml 蒸馏水密封。

室温静置 1h 待其凝固。

凝固之后倒掉蒸馏水，并用滤纸将胶面吸干。

浓缩胶的配制胶浓度5%单体母液（ml）0.75去离子水（ml） 3.00浓缩胶缓冲液（ml） 1.2510%APS（μl）40TEMED（μl）12共配制 5ml 胶液，合适本实验双槽式电泳槽两板胶用量。

倒好胶后，插好梳子，使梳子孔中无气泡。

室温静置1h 待其凝固。

4、上样及电泳：以10μl移液器上样10μl，电泳条件主要采用稳压的方式：样品在浓缩胶时的电压为 47-50V，此时相应的电流一般是 16-18mA；电泳 1.5h 后，样品大概在分离胶时调节电压 125-145V，此时相应的电流为 30-35mA，电泳时间约 4h。

5、染色、脱色：电泳结束后，撤下胶板，切去浓缩胶，小心揭下分离胶，固定液漂洗 20min 后放入适量新鲜染色液染色 1h。

弃去染色液，用自来水漂洗至漂洗液无颜色，倒入适量脱色液脱色，隔 2h 换一次脱色液，直至凝胶出现清晰地条带为止。

3、Elisa 大豆球蛋白（酶联免疫法）检测方法提供方：国家饲料工程技术研究中心产品：大豆球蛋白（Glycinin）定量测定试剂盒，生产厂家：北京龙科方舟生物工程技术有限公司原理本试剂盒采用间接竞争ELISA 方法，在酶标板微孔条上预包被大豆球蛋白抗原，样品中的大豆球蛋白和微孔条上预包被抗原竞争抗大豆球蛋白抗体，加入酶标二抗后，用TMB 底物显色，样品吸光度值与其所含大豆球蛋白的含量成负相关，与校准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数即可得出样品中大豆球蛋白的含量。

适用范围可定量检测大豆及其深加工产品（豆粕、发酵豆粕、膨化大豆、大豆分离蛋白、大豆浓缩蛋白等）中大豆球蛋白的含量。

试剂和组成（1）试剂（2）其它盖板膜 3 张、自封袋 1 个、移液器吸头 10 个步骤：（1）试剂配制1X样品提取工作液的配制：将30X样品提取液用双蒸水或去离子水按1：29体积比进行稀释（例如配制总体积为300ml1X样品提取液，首先量取290ml双蒸水或去离子水置于容器中，再量取10ml30X 样品提取液加到装有290ml双蒸馏水或去离子水的容器中混匀即得），用于样品中大豆球蛋白的提取。

1X洗涤工作液的配制：将20X浓缩洗液用双蒸水或去离子水按1：19体积比进行稀释（例如配制总体积为200ml1X洗涤工作液，首先量取190ml双蒸水或去离子水置于容器中，再量取10ml20X 浓缩洗液加到装有190ml双蒸馏水或去离子水的容器中混匀即得用于酶标板的洗涤。

（2）样品前处理将待检样品粉碎成60目以上颗粒，称取0.1g样品加入到已配好的30ml1X样品提取工作液中（见试剂配制），于25℃振荡提取12-16小时，静止20分钟,取上清液用样品稀释液稀释到工作浓度，建议每份样品稀释成多个浓度（豆粕、发酵豆粕、膨化大豆样品建议稀释比例为1:300）。

（3）样品检测1.将所需试剂从冷㯿环境中取出，置于室温（20-25℃）平衡30分钟以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2.取出需要数量的酶标板条，将不用的酶标板条放入自封袋，于2-8℃干燥保存。

3.洗涤工作液在使用前也需回温。

4.编号：将样品和校准品对应微孔按序编号，每个样品和校准品做2孔平行，并记录校准品孔和样品孔所在的位置。

5.加校准品/样品：将6种校准品以及待测样品各50ul到对应的微孔中，再加入抗体工作液50ul/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30分钟。

6.洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液（见试剂配制）300ul/孔充分洗涤5次，每次浸泡10秒，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头戳破）。

7.加酶标试剂：加入酶标试剂100ul/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光反应30分钟，取出重复洗板步骤6。

8.显色：将等体积底物液A与底物液B放入干净容器中，振荡混匀。

加入AB混合液100ul/孔，用盖板膜盖板后，置37℃避光反应15分钟。

9.测定：加入终止液50ul/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm 处（建议用双波长与 450/630nm 检测，在 5 分钟内读完数据），保存每孔吸光度值。

（4） 结果计算结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。

注意样品吸光值与大豆球蛋白的含量成负相关。

1.用样品的平均吸光度值 校准值比较即可得出其浓度范围。

例如样品1的吸光度值为 0.301，样品2的吸光度值为0.712，校准品吸光度值分别是：0ug/ml 为1.952；0.1ug/ml 为1.420；0.3ug/ml 为0.980；0.9ug/ml 为0.464；2.7ug/ml 为0.256；8.1ug/ml 为0.152。

则样品1的浓度范围是0.9ug/ml-2.7ug/ml ，再乘以其对应的稀释倍数即可得出样品中大豆球蛋的浓度范围；样品2的浓度范围是0.3ug/ml-0.9ug/ml ，再乘以其对应的稀释倍数即可得出样品中大豆球蛋白的浓度范围。

2. 定量分析2.1 百分吸光率的计算校准品或样品的百分吸光率等于标准品或样品的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即 百分吸光度值（%）=BB0×100%B —校准品2-6溶液或样品溶液的平均吸光度值 B0—校准品1的平均吸光度值2.2 校准曲线的绘制与计算以校准品百分吸光率为纵坐标，以大豆球蛋白校准品浓度的对数为横坐标，绘制校准曲线图。

将样品的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样品所对应的浓度， 乘以其对应的稀释倍数即为样品中大豆球蛋白的实际浓度。

如图：也可利用试剂盒所带配套分析软件，便于大量样品的准确、快速分析。

性能参数（1）样品线性回归与预期浓度相关系数≥0.98 。

（2）批内变异系数≤10%批间变异系数≤15%注意事项（1）室温低于20℃或试剂及样品没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的吸光度值偏低。

（2）在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。

所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

（3）每加一种试剂前需要将其摇匀。

（4）反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。

（5）不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。

（6）储存条件保存试剂盒于2-8℃，不要冷冻，将不用的微孔板放进自封袋重新干燥密封。

校准品和底物液B 对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

（7）试剂变质的迹象：发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。