微生物学实验复习
3、培养基得配置原则：
(1)目得要明确(根据微生物得种类、培养目得等)，如培养基可由简单得无机物组成，生产用培养基内可加入化学成
分不明确得天然物质，而分类、鉴定用培养基内必须加入已知化学成分得物质。

(2)营养要协调：注意各种营养物质得浓度与比例。

(3)pH要适宜：各种微生物适宜生长得pH范围不同，如细菌、放线菌与真菌得最适pH分别
为：6、5～7、5、7、5～8、5与5、0～6、0。

5、细菌培养基得配制过程？
答：配制培养液→调节PH →分装→包扎→灭菌→搁置斜面（搁置斜面得长度不超过试管总长得1/2） 【问题与探究】
（1）培养基灭菌后，为什么需要冷却到50 ℃左右时，才能用来搁置斜面或倒平板？您用什么办法来估计培养基得温度？
【提示】 琼脂得凝固点为40 ℃，温度太高易使培养皿破裂，低于40 ℃，培养基已凝固，倒不出，所以培养基灭菌后，需冷却到50 ℃左右时才能用来倒平板，可以用手触摸盛有培养基得试管，感觉试管得温度下降到刚刚不烫手时就可以进行倒平板了。

（2）为什么需要使试管口通过火焰？
【提示】 通过灼烧灭菌，防止试管口得微生物污染培养基。

（3）为了能彻底灭菌，在操作过程中应注意哪些事项？
【提示】 使用高压蒸汽灭菌锅时，加压之前一定要把原先得空气排尽，注意恒温灭菌，同时要注意高压蒸汽灭菌锅得压力(100 kPa)、温度(121 ℃)与灭菌时间(20 min)。

6、无菌操作与接种技术 (1)接种
概念：在_无 菌 条件下将微生物接入 培养基____得操作过程。

工具：玻璃刮铲、接种针与接种环。

方法：穿刺接种、斜面划线接种与平板划线接种、涂抹平板等。

（2）无菌操作
——微生物接种技术得关键
①培养微生物用得试管、培养皿与微生物培养基等，在接种之前都需要 灭菌_。

②通常接种操作要在____酒精灯火焰__得附近进行。

【想一想】 在微生物得培养过程中为什么要进行无菌操作？
提示：无菌操作得目得就是防止受到空气中得杂菌污染。

7、微生物得分离
（1）原理：根据微生物对_营养成分、氧气、pH 等要求得不同，通过只提供目得微生物生长得必需条件，或加入某些抑制剂使非目得微生物不能生长，从而达到 选择分离 微生物得目得。

(2)方法
①据菌落形态特征初步分离 ②常用方法——平板分离法
分类⎩⎪⎨⎪⎧_____________
混合平板法
______________
：就是常用得平板分离法，有扇形划线、 连续划线、交叉划线与方格划线等
目得：在培养基上得到目得微生物得 单个 菌落 【归纳】无菌技术得具体内容
(1)对实验操作得空间、操作者得衣着与手进行清洁与消毒。

(2)将用于微生物培养得器皿、接种用具与培养基等进行灭菌。

(3)实验操作应在酒精灯火焰附近进行，以避免周围环境中微生物得污染。

(4)实验操作时应避免已灭菌处理得材料用具与周围物品接触。

（5）在微生物得实验室培养中，无菌技术得核心就是防止杂菌污染，保证培养物得纯度。

8、平板分离法
①原理：大多数细菌、许多真菌与单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立得菌落。

平板分离法能将单个微生物分离与固定在固体培养基表面或里面，每个孤立得活微生物体经过生长、繁殖均可形成便于移植得菌落。

②常用培养基：最常用得分离、培养微生物得固体培养基就是琼脂固体培养基。

③、方法：(1)涂抹平板法：分离材料进行10倍系列稀释，取一定稀释度样品倒入预先准备好得琼脂平板，用无菌玻璃刮铲将样品涂布均匀，细菌菌落常仅在平板表面生长。

(2)混合平板法：分离材料进行10倍系列稀释，取一定稀释度样品与溶化得琼脂混合，将
与样品混合得琼脂倒入无菌平皿，细菌菌落出现在平板表面及内部。

(3)平板划线法：有扇形划线、连续划线、方格划线等。

4、目得：通过采用各种平板分离法在培养基上得到目得微生物得单个菌落。

(1)灭菌后得接种环须冷却后再挑取菌种，否则会杀死菌种。

(2)整个操作过程要在酒精灯火焰旁进行，避免杂菌污染。

(3)划线时用力大小要适当，防止用力过大使培养基划破。

9、菌落数目得统计方法 (1)显微镜直接计数法
①原理：此法利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积得样品中微生物得数量。

②方法：用计数板计数。

计数板就是特制得载玻
片，其上有特定得面积为1 mm2，高为0、1 mm 得计数室，一个计数室又被分成25个(或16个)中
格，每个中格再被划分成16个(或25个)小格，每个计数室都由400个小格组成。

③操作：将稀释得样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计数4～5个中格中得细菌数，并求出每个小格所含细菌得平均数，再按计算公式求出每毫升样品中所含得细菌数。

④计算公式
每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数。

⑤缺点：不能区分死菌与活菌。

（2）间接计数法(活菌计数法)
涂抹平板法 平板划线法
①原理：当样品得稀释度足够高时，培养基表面生长得一个菌落，来源于样品稀释液中得一个活菌，通过统计平板上得菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。

②操作
⒈设置重复组，增强实验得说服力与准确性。

将待测样品经一系列10倍稀释，然后选择三个稀释度得菌液，分别取0、1 mL接种到已制备好得平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂布在整个平板表面，放在适宜得温度下培养计数菌落
数。

为使结果接近真实值，可将同一稀释度菌液加到三个或三个以上得平板上，经涂布、培
养，计算出菌落平均数。

2、为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300得平板进行计数，若设置得重复组中结果相差太远，意味着操作有误，需重新实验。

(3)滤膜法
①实例：测定饮用水中大肠杆菌得数目。

②过程：将已知体积得水过滤后，将滤膜放于伊红美蓝培养基上培养，在该培养基上，大肠杆菌菌落呈现绿色，并带有金属光泽可根据培养基上绿色得菌落数目，计算出水样中大肠杆菌得数量。

【特别提醒】
统计菌落数目得注意事项：
①一般选择菌落数在30～300得平板进行计数。

②统计得菌落数往往比活菌得实际数目低。

③统计结果一般用菌落数而不就是用活菌数表示。

④设置对照，目得就是排除实验组中无关因素对实验结果得影响，提高实验结果得可信度。

实验探究：微生物得分离
【操作与实践】
微生物得分离包括样品稀释、划线或涂布及培养三个步骤。

1、稀释
用1 mL无菌吸管吸取1 mL大肠杆菌培养液，加入到盛有9 mL无菌水得大试管中，充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1 mL加入另一支盛有9 mL无菌水得试管中，混合均匀，依次类推制成10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6系列稀释度得大肠杆菌稀释液。

2、划线或涂布
(1)平板划线分离法——在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取大肠杆菌培养液在平板上划线，常用得划线方法有平行划线与连续划线两种(如图)。

平行划线时，每转一个角度烧一次接种环。

划线完毕后，盖上培养皿盖，做好标记。

特别提醒
平板划线法中得注意事项
①取菌种之前及每次划线之前都需要将接种环灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每
次灼烧目得
如下表：
取菌种之前每次划线之前划线结束
目得
杀死接种环上原
有得微生物
杀死上次划线后接种环上残留得菌种，
使下次划线得菌种直接来源于上次划
线得末端，使每次划线后菌种数目减少
杀死接种环上残存得菌种，避免细菌
污染环境与感染操作者
②从第二次以后得划线操作总就是从上一次划线末端开始，能使细菌得数目随着划线次数得增加逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来得菌落。

(2)涂布分离法——取3个平板，底面分别用记号笔写上10－4、10－5与10－6三种稀释度，然后用无菌吸管分别吸取相应稀释度得稀释液各0、1 mL，放入已标记好得平板上，用无菌玻璃刮铲在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置5～10 min，使菌液吸附进培养基(如图)。

特别提醒
①将玻璃刮铲末端浸在盛有体积分数为70%得酒精得烧杯中。

取出时，要让多余得酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精得玻璃刮铲在火焰上引燃。

②操作中一定要注意防火，不要将过热得玻璃刮铲放在盛放酒精得烧杯中，以免引燃其中得酒精。

3、培养
将划线或涂布接种得平板倒置于37 ℃培养箱
中，培养16～24 h，即可长出单菌落。

【问题与探究】
1、在涂布平板操作中，如何避免杂菌污染？
【提示】(1)酒精灯与培养皿得距离要适中。

(2)接种环、玻璃刮铲不能接触任何物体。

(3)接种环要用酒精灯灼烧。

(4)将沾有少量酒精得玻璃刮铲在火焰上引燃。

2、未接种得培养基表面有菌落生长，说明了什么？
【提示】如果未接种得培养基在恒温箱中保温1～2 d后有菌落生长，说明培养基灭菌失败，需要重新制备。

3、在接种大肠杆菌得培养基上，您就是否观察到了独立菌落？
【提示】如果培养基上生长得菌落得颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落特点，则说明接种操作符合要求；如果培养基上出现其她菌落，有其她杂菌混杂，可再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。