头孢类、 碳青酶烯类、单环B-内酰胺类）
糖肽类（主要针对G+菌） 氨基糖苷类 大环内酯类（G+菌或苛养的G-菌） 四环素类
喹诺酮类
磺胺类和甲氧苄啶 单一药物类（氯霉素、克林霉素、利福平、呋喃妥因）
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A组：常规首选药敏试验组合 B组：包括一些临床上重要的，特别是针对医院内感染的药物。在下列情况时可以选择
稀释法 定量、较准确报告 最低抑菌浓度（MIC） 操作复杂 不是连续浓度梯度 任何细菌污染都会 影响结果
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－琼脂稀释法
Q:
请设计琼脂稀释法试验，获得美罗培 南对80株测试大肠杆菌的MIC值。
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－琼脂稀释法

主要材料：MH琼脂 美罗培南药粉（纯度91％） 点种器
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－纸片扩散法

操作步骤
制备接种物（0.5麦氏单位）
接种（15分钟内接种，涂抹均匀）
在接种好的琼脂平板上贴加纸片 孵育（15分钟内反转平板，35°C空气孵育）
苛养菌5％CO2孵育
判度结果和解释结果
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－纸片扩散法

判读结果
将游标卡尺置于反转的平板的背面，测量到最接近的整数毫米数。平板 应距离一个黑色不反光的背景数英寸，并用反射光照明。 如果是加血的琼脂培养基，则应在透射光照射下，打开培养皿盖，从上 表面测量抑菌圈。
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－琼脂稀释法
准备对倍稀释的药液 准备菌液 制备含抗生素的琼脂平皿 点种菌液
孵育
读MIC值
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－琼脂稀释法

抗生素用量计算
W=母液浓度×母液体积/药物纯度 =(256ug/ml×25倍)×4ml/0.91
母液浓度依各个试验具体情况而定
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－纸片扩散法
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－纸片扩散法
试剂 Mueller-Hinton琼脂培养基 抗生素药片 接种物（细菌悬液）
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－纸片扩散法


MH平皿的标化
（1）厚度4mm （2）pH7.2－7.4（pH过低，氨基糖苷类与大环内脂类失活，青霉素类 活性增强） （3）湿度 （4）胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶（TMP/SMZ-ATCC29212,抑菌圈 ≥20mm） （5）二价阳离子含量：影响氨基糖苷类对绿脓杆菌、四环素对所有细 菌的实验结果。过低，活性增强；过高，活性减弱） （6）某些苛养菌，需要在MH琼脂中添加其他物质或使用其他培养基 （7）若当天不使用，储存于2-8°C，七天内使用。
－琼脂稀释法

对倍稀释药液
药物的溶解液和稀释液参照CLSI/NCCLS M100-S15文件 用灭菌蒸馏水稀释至最低浓度为0.004×25ug/ml(一般比质控范 围低限低一个稀释度） 质控范围：ATCC25922 0.008-0.06 ATCC27853 0.25-1
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－琼脂稀释法

菌液的准备 新鲜菌落 0.5麦氏单位（108CFU/ml） 1：10稀释（107CFU/ml） 15分钟内接种
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－琼脂稀释法
点种器点种（每块平皿可点52个点） 每个点为1-2ul,即104CFU 注意：接种最初和最后要分别点种两块不含抗生素的 MH平皿 “质控前“（检查生长菌的生长性和纯度） “质控后“（检验在接种过程中有无污染）
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北京协和医院2004年 1221株eco对TZP的抑 菌圈直径分布
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北京协和医院2004年 518株aba对IMP的抑 菌圈直径分布
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－纸片扩散法


质控
目的：监测药敏精密度和准确度；监测试剂质量；监测操作者水平。

质控菌：ATCC25922、ATCC27853、ATCC25923等
Each laboratory should decide which agents in the tables to report routinely(Group A) and which might be reported only selectively (from Group B),in consultation with the infectious disease practitioners and the pharmacy,as well as the pharmacy and therapeutics and infection control committees of the medical staff of the hospital.
试验原理：
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平
板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片
周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内 测试菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌
圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测试药物的敏感程度，并与
该药对测试菌的MIC呈负相关。
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药物敏感性试验方法 (Antimicrobial Susceptibility Test)
北京协和医院 检验科 细菌室 杨启文
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何时需进行细菌的药敏试验？
当一细菌是需要抗微生物药治疗的某感染过程 的病原菌，而其敏感性不能从细菌的种属特性可 靠地推知时，就需要进行药敏试验。 当病原菌被认为是属于对常用抗生素能产生耐 药的菌种时，更需进行药敏试验。
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－琼脂稀释法
制备含抗生素平皿
将1ml抗生素液与24ml MH琼脂混匀，待其凝固。 注意：琼脂不可过热 药液和琼脂要充分混匀 若检测链球菌的敏感性，则推荐MH琼脂在被 高压灭菌并冷却后，以无菌手续加入5％(v/v) 脱纤维羊血或马血并检测pH。
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－琼脂稀释法

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－琼脂稀释法

将结果输入WHONET软件进行统计分析
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Байду номын сангаас12
－纸片扩散法


抗生素药片
（1）－14°C以下冷冻至使用前。B－内酰胺类应密封包装并冷冻，某 些不稳定的药物（如亚胺培南、头孢克罗、克拉维酸复合药）应冷冻保 存直至使用。 （2）装有纸片的容器应于使用前1-2小时移出冰箱，平衡至室温才能打 开。以防止纸片上冷凝水产生。 （3）当指示剂变色时，应更换干燥剂以防止过于潮湿。
性报告：(1)对A组同类抗生素耐药时(2)特定的标本来源（如三代头孢对脑脊液中的肠道杆 菌，TMP/SMZ对泌尿道中的分离菌株）（3)多种细菌感染（4)多部位感染（5)对A组药过 敏、耐受或无效的病例（6)为流行病学调查目的向感染控制组报告。

C组：包括某些医院需要测试的替代性或补充性抗生素（由于该地区存在对某些首选药
只要平均抑菌圈直径没有发生由于方法错误造成的有意义的改变，质控 培养物就可以一直用于监测试验的精密度和准确度。如果某意外结果提 示该菌株的内在敏感性发生改变，就应该换用此质控株的新培养物。

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－琼脂稀释法

纸片法 经济、常规应用有 统一的实验室标准 只能检测需氧菌 及兼性厌氧菌。 极易受实验室条 件影响。
物耐药的菌株）。

U(Urine)组： 仅用于尿道中分离细菌的药敏试验，其他部位的感染不用此组药物进
行试验。

O(Other)组：可能有临床使用指征，但在美国不作为常规测试和报告。

Inv(Investigational)组：目前正在进行抗菌活性评估，还未被FDA批准。
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－纸片扩散法
如果被测菌是葡萄球菌或肠球菌，则应孵育24小时，再在透射光下分别 观察苯唑西林或万古霉素的透明抑菌圈内有无耐甲氧西林或耐万古霉素 菌落的微弱生长。
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－纸片扩散法

判读结果
如果在透明的抑菌圈内有任何的单个菌落，则应进行二次培养，重新鉴 定和重新试验。 对于变形杆菌属，在本该十分明显的抑菌圈内的薄纱样蔓延生长应该忽 略。
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何时不需进行细菌的药敏试验？

若感染的性质不清楚、标本含数种混合生长的菌或 正常菌群，而且这些菌与正在治疗的感染关系很小 时，通常不必作药敏试验，因为其实验结果可能有 误导作用。 若感染是由公认的对高效药物敏感的微生物引起， 就很少需要作药敏试验。

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Selective Reporting
CLCI M100-s15
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菌－－药敏方法
测试菌

药敏方法 纸片扩散法(M2-A8) 琼脂稀释法 稀释法 (M7-A6) 肉汤稀释法 微量(0.1ml)
普通需氧菌和兼性厌氧菌 苛养菌 厌氧菌


宏量(2ml)
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可选用的抗生素
B－内酰胺类（青霉素类、B-内酰胺/B-内酰胺酶抑制剂复合药、
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－琼脂稀释法
吹干
将平皿倒置，35°C,普通空气孵育16-20h
读MIC值
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－琼脂稀释法
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