微生物学实验指导书目录实验一实验室环境和人体表面微生物的检查 (2)实验二普通光学显微镜的使用和细菌的简单染色 (5)实验三细菌的革兰氏染色和芽孢染色 (12)实验四放线菌和真菌的制片、染色和形态观察 (16)实验五酵母菌形态观察与死活细胞鉴别及显微镜直接计数法 (20)生命科学学院微生物学教研室编写实验一实验室环境和人体表面微生物的检查微生物以其微小的形体广泛地分布在自然环境的各个角落，包括空气、土壤、水、动植物、人体的体表和某些脏器。

在有人群活动的场所，特别是人口密度相对大的一些地方，如：商场、影剧院、会议室、教室、实验室等都会散落着细菌的营养体、芽孢和霉菌的孢子。

只不过因为它们体积太微小（细菌的大小在1~10μm之间），远远低于人肉眼的分辨极限（人眼的正常分辨能力一般为0.25mm，即250μm），而看不见它们，但它们确实真实存在。

由于空气、器具、器皿、人体体表等处缺乏微生物进行繁衍所需要的足够水分和营养物，它们只是“暂居”于此。

一旦满足它们的营养要求，在适宜的温度条件下，它们将迅速地生长、繁殖，其“子孙后代”将会聚集在一起，形成一个人眼可见的群体——菌落。

不同微生物形成的菌落差异很大，人们可根据菌落的形状、大小、质地、颜色对它们进行表观的判断和认识。

不同环境条件中栖息的微生物有所不同，有些是对人无害的腐生菌，有些是致病菌，有些则是改变条件才可致病的条件致病菌。

本实验是对初学者的入门实验，通过从实验室内空气、实验者的头发、皮肤、手指、钱币等处取样，接种于营养琼脂培养基，37°C培养1~2天，可验证微生物的存在，并观察微生物菌落的形态和数量。

一、实验器材1.培养基肉膏蛋白胨琼脂平板。

2.溶液和试剂无菌水。

3.仪器和其他用品灭菌湿棉签，试管架，酒精灯，记号笔，镊子，废物缸等。

二、目的要求1.通过实验确证在实验室内的空气、器、物和人体体表上存在着微生物。

2.比较来自不同场所与不同条件下细菌的数量和类型，观察不同类群微生物的菌落形态特征。

3.体会无菌操作的重要性。

三、基本原理进入空气中的微生物菌体和霉菌的孢子，或“漂浮”在空气中，或附在空气中细小的尘埃上，或沉落在桌面、地面、人体体表的皮肤、手指上；实验室的门把手、钱币经多人的触摸也会沾染微生物，有时甚至会污染病原微生物。

如何知道我们周围存在看不见的微生物呢?也就是说如何使“看不见”变得“看得见”呢?显微镜技术是其中一种方法，这是通过放大微生物个体，使我们能够看到它们；另一种方法是通过“放大”成子细胞群体(菌落)，使我们看到它们的存在，即通过培养的方法使肉眼看不见的单个菌体在固体培养基上，经过生长繁殖形成几百万个菌聚集在一起的肉眼可见的菌落(colony)。

本实验将采取后一种方法检查实验室环境和人体表面的微生物，从而使学生牢固树立“无菌概念”。

平板培养基含有细菌生长所需要的营养成分，当取自不同来源的样品接种于培养基上，在37°C温度下培养，1~2天内每一菌体即能通过很多次细胞分裂而进行繁殖，形成一个可见的细胞群体的集落，称为菌落。

每一种细菌所形成的菌落都有它自己的特点，例如菌落的大小，表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑，边缘整齐或不整齐，菌落透明或半透明或不透明，颜色以及质地疏松或紧密等。

霉菌和放线菌在培养基上形成紧密或疏松的菌丝，菌丝体上生成不同颜色和不同形状的孢子，其菌落也有絮状、蛛网状、绒状和放射状等明显的特征。

因此，通过营养琼脂平板上生长出的微生物菌落，可以确证微生物在自然环境中的存在，根据菌落的形态特征可以初步识别各种不同类群的微生物。

四、操作步骤1.标记任何一个实验，在动手操作前均需首先将器皿用记号笔做上记号，培养皿的记号一般写在皿底上。

如果写在皿盖上，同时观察两个以上培养皿的结果，打开皿盖时，容易混淆。

用记号笔写上班级、姓名、日期，本次实验还要写上样品来源（如实验室空气或无菌室空气或头发等），为了不影响观察，可用符号或数字代表(图I-1)。

2.人体表面微生物的检查(1)手指表面：在火焰旁，半开皿盖，用洗前的手指在平板的A区轻轻按一下，迅速盖上皿盖。

然后用肥皂清洗手2次，自然干燥后，在B区轻轻按一下，迅速盖上皿盖。

(2)头发：将你的1-2根头发轻轻放在平板的C区，迅速盖上皿盖。

(3)皮肤：酒精灯火焰旁取出灭菌的湿棉签在自己的任意皮肤上擦拭数次后，立即在平板的D区轻轻摩擦2-3次，盖上皿盖，将用过的棉签扔到废物缸中。

3.实验室环境的检查（取样的来源可以延伸••••••）(1)以组为单位开展本实验，每组准备一个平板，标记为“实验室空气”，在实验室打开皿盖，使琼脂培养基表面完全暴露在空气中；另全班准备一个平板标记“无菌操作”的平板直接放在培养箱中培养，作为大家的对照。

(2)酒精灯火焰旁取出灭菌湿棉签，在实验台面擦拭约2cm2的范围，然后将棉签从平板的开启处伸进平板表面，在图I-1标示的E区滚动一下，立即闭合皿盖，放回棉签。

(3)用同样的方法将擦拭了门旋钮的棉签在图I-1标示的F区进行滚动接种，将沾有灰尘的棉签在G区接种。

将灭菌棉签在H区接种。

4.培养将所有的琼脂平板翻转，使皿底朝上，置37°C培养1~2 d。

本实验为什么用肉膏蛋白胨琼脂培养基和37°C温度?首先需要记住的是：没有一种条件或培养基能使所有的微生物生长。

本实验中所用的培养基是一种丰富培养基，可以支持大量不同的微生物生长，因此可以满足本实验的要求。

生物最理想的生长温度通常是它们赖以生存的自然环境的温度，很多微生物，特别是来自动物或人体的微生物在37°C生长良好，该温度也能支持很多最适自然温度为28-30°C的生物生长，符合本实验的需要。

五、实验报告1.微生物检查结果将平板培养结果记录于下表I-1中，并作简要说明：根据菌落大小、形状、高度、干湿等特征观察不同的菌落类型。

但要注意，如果细菌数量太多，会使很多菌落生长在一起，或者限制了菌落生长而变得很小，因而外观不典型，故观察菌落的特点时，要选择分离得很开的单个菌落。

菌落特征描写方法如下：（a）大小：大、中、小、针尖状。

可先将整个平板上的菌落粗略观察一下，再决定大、中、小的标准，或由教师指出一个大小范围。

（b）颜色：黄色、金黄色、灰色、乳白色、红色、粉红色等。

（c）干湿情况：干燥、湿润、粘稠。

（d）形态：圆形、不规则等。

（e）高度扁平、隆起、凹下。

（f）透明程度：透明、半透明、不透明。

（g）边缘：整齐、不整齐。

2.思考题(1)列举2－3类微生物，说明它们在本实验条件下(牛肉膏蛋白胨琼脂平板，37°C)不能生长。

(2)比较各种来源的样品，哪一种菌落数和菌落类型最多?为什么?(3)比较洗手前后菌落数的变化，谈谈你的体会。

洗手后仍有少量细菌生长，你认为是什么原因?为什么接种完毕后，接种环还必须灼烧后再放回原处，吸管也必须放进废物筒中?(4)完成本实验后，你是否已体会到我们生活在微生物的包围中?你如何体会“微生物既是我们的朋友又是我们的敌人”?实验二普通光学显微镜的使用和细菌的简单染色微生物的最显著特征就是个体微小，一般必须借助显微镜才能观察到它们的个体形态和细胞结构。

熟悉显微镜和掌握其操作技术是研究微生物不可缺少的手段。

本实验将对目前微生物学研究中最常用光学显微镜的原理、结构、观察技术进行介绍，目的在于使同学们通过实验重点掌握明视野普通光学显微镜中油镜的使用。

微生物中的细菌，其细胞小而透明，用压滴片或悬滴片在光学显微镜下观察时，菌体和背景没有明显的明暗差，不易看清其形态，更难以识别它们的结构。

因此，需要对菌体进行染色，借助于染料使菌体着色后颜色的反衬作用，可以十分清楚地观察到细菌的形状、基本结构（壁、膜、细胞质、核及内含物）及附属结构（荚膜、鞭毛、菌毛、芽孢等）。

用于微生物染色的染料，是一类苯环上带有发色基团和助色基团的有机化合物。

发色基团赋予颜色特征，助色基团则使化合物具有成盐的性质。

仅含发色基团的苯化合物（称为色原）即使带有颜色也不能作为染料，因为它不能电离，不能与酸或碱成盐，与微生物细胞表面的负电荷没有亲合力，不能着色。

染料通常都是苯化合物的盐类，分为酸性染料和碱性染料两大类。

在微生物染色中，常用碱性染料，当其电离后带有正电荷，可与细胞表面的负电荷靠静电作用使细胞着色。

美蓝（即亚甲基蓝）、结晶紫、碱性复红、沙黄（即番红花红）、孔雀绿等都属于碱性染料。

一、实验器材1．菌种：大肠杆菌（Escherichia coli），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

枯草芽胞杆菌12-18 h牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌24 h牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物。

枯草芽胞杆菌和金黄色葡萄球菌分别为典型的杆状和球状细菌，通过观察可以熟悉细菌的两种基本形态，同时还可以看到金黄色葡萄球茵细胞聚集形成葡萄串状的群体特征。

2．染液：简单染液：草酸镀结晶紫染液，齐氏石炭酸复红染液，吕氏碱性美蓝染液，沙黄（番红）复染液。

3．用具：普通光学显微镜、酒精灯、接种环、无菌水、香柏油、二甲苯、载玻片、镜头纸、镊子、染色缸、火柴等。

二、目的要求1．复习普通光学显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。

2．学习并掌握油镜的原理和使用方法。

3．学习微生物的涂片，制片及简单染色的操作技术。

4．掌握微生物的简单染色的基本原理和方法。

三、基本原理1．普通光学显微镜。

现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。

它们由机械装置和光学系统两大部分组成(图III-1)。

在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。

而在普通光学显微镜通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要，与其他物镜相比，油镜的使用方法比较特殊，需要在载玻片和镜头之间加滴镜油，这主要有如下两方面的原因：1）增加照明亮度油镜的放大倍数可达100x，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，但所需要的光照度却很大(图III-2)。

而从显微镜的结构看(图III-3)，从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同(从玻片进入空气，再进入镜头)，有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头，致使在使用油镜时会因射入的光线较少，物像显现不清。

所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时须在油镜与玻片之间加入与玻璃的折射率(n=1.55)相仿的镜油(通常用香柏油，其折射率n=1. 52)。

2）增加显微镜的分辨率显微镜的分辨率(resolution)或分辨力(resolving power)是指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力(图III-4)。