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免疫磁珠分离法
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（二）巨噬细胞的分离
☆斑蝥敷贴法分离人巨噬细胞 ☆动物的巨噬细胞直接从腹腔渗出液中获取
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（三）中性粒细胞的分离
聚合物加速沉降法 可从外周血中分离出白细胞
WBC
• Ficoll分离法 可从白细胞中分离出纯化的中性粒细胞
血浆
RBC
RBC
(抗凝血)
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Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离中性粒细胞
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外周血各细胞成分的密度
细胞 血小板
PBMC
多核白细胞
红细胞
比重
1.030~1.035 1.075~1.090 1.092
1.093
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一、Ficoll分离法
Ficoll分离液法是一种单次差速密度梯度离心的分 离法，主要用于分离外周血中的单个核细胞。
原理： Ficoll分层液：密度1.077±0.001 离心：密度梯度离心 分离：各类细胞按其相应密度重新分布
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免疫细胞种类
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第一节 吞噬细胞的分离和收集
吞噬细胞的种类 ﹡大吞噬细胞:即单核-吞噬细胞系统 ﹡小吞噬细胞:即中性粒细胞
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一、吞噬细胞的分离
（一）单核细胞的分离
特征性标志 CD14 分离技术 • Pecoll密度梯度分离法 • 流式细胞仪分离技术 • 免疫磁珠分离法：为目前较常用的方法 • 黏附法
第十章 免疫细胞的分离和功能检测
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目录
第一节 吞噬细胞的分离和收集 第二节 外周血单个核细胞的分离和纯化 第三节 淋巴细胞及其亚群的分离
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免疫细胞的分离及检测
免疫细胞的分离 是指将各种参与免疫反应的 细胞从血液或组织中分离出来
※检测：各类免疫细胞及其亚群的数量和功能测定 ※方法：体外法为主 ※目的：判断机体免疫状态 ※意义：探讨疾病的发病机制、发展、预后、疗效
原理及技术要点 在一特制的分上下两层的小盒，将趋化因子加入
下室，待检细胞加入上室，两室用微孔滤膜分隔， 37℃温育数小时后，上室的中性粒细胞受下室趋化 因子的吸引，由滤膜微孔进入滤膜内，取滤膜清洗、 固定、干燥、染色和透明，在高倍镜下观察细胞穿 越滤膜的移动距离，从而判断其趋化功能。
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琼脂糖平板法
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免疫磁珠分离法
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流
式
488 nm 激光
细
胞
术
分 离 原
-
电磁场
理
示
单个细胞被分类
意
进入检测管
图
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前向散射光 检测器
荧光检测器
+
E花环沉降法
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三、相关功能检测
T细胞功能检测 B细胞功能检测 NK细胞功能检测
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T细胞功能检测
T细胞增殖试验 T细胞介导的细胞毒试验 MHC-肽四聚体技术 淋巴细胞内细胞因子检测
原理及技术要点
在琼脂糖凝胶平板的中孔加白细胞悬液，左孔加 趋化因子，右孔加对照液，温育4～8小时后，用显 微镜测微器测定中性粒细胞向左孔的移动距离A和 向右孔的移动距离B，计算趋化指数。
趋化指数= A/B 趋化指数越大，表明中性粒细胞运动功能越强
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（一）中性粒细胞吞噬功能检测
显微镜检查法
吞噬率 (%)吞噬细菌的白细1胞00数 计数的白细胞数
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淋巴细胞转化的检测方法
形态学检查法 3H-TdR掺入法 MTT比色法
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形态学检查法
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未转化和转化淋巴细胞的形态特征
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Ficoll分层液分离单个核细胞示意图
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Percoll分离单个核细胞示意图 78％ 98％
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第三节 淋巴细胞及其亚群的分离
一、淋巴细胞的纯化
﹡红细胞的去除：低渗裂解法、氯化铵裂解法 ﹡血小板的去除 ：胎牛血清梯度离心法
﹡单核细胞的去除：黏附法 羰基铁吞噬法（磁铁吸引法） 苯丙氨酸甲酯去除法
体外试验法：滤膜渗透法
琼脂糖平板法
皮肤窗法 在受检者前臂屈侧中央3㎜范围内，搔刮 皮肤后，用盖玻片压紧固定，在第2，5，8，12， 24，36小时各取样一次，染色观察中性粒细胞聚集 开始时间、聚集程度等。健康正常人一般2～3h后
开始聚集，达50～100个，6小时可达1000个以上。
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滤膜渗透法
炭粒廓清试验 正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90％炭粒，脾巨噬 细胞约吞噬清除10％炭粒。据此给小鼠静脉注射定量 印度墨汁（炭粒悬液），间隔一定时间反复取静脉血， 测定血中炭粒的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度， 判断巨噬细胞的功能。
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吞噬功能检测
孵育
Mф +CRBC
涂片、染色、镜检
计算、吞噬率、吞噬指数
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T淋巴细胞增殖试验
刺激物 淋巴细胞
DNA合成 母细胞
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分化
-
细胞变大 细胞浆扩大 空泡 核仁明显 核染色质疏松
淋巴细胞转化的刺激物
非特异性刺激物： PHA ------ T细胞 ConA ------ T细胞 PWM ------ T、 B细胞 LPS ------ B细胞
特异性刺激物： 异种抗原 同种组织抗原
吞噬指数=
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杀菌功能检测
NBT还原试验
原理：
N-N-
C
+ H+
N=N-R-
四氮唑基（淡黄色）
N-NH2 C N=NH
甲chan（紫黑色）
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NBT还原试验
方法：
1.抗凝血 + 硝基蓝四氮唑（NBT），37℃孵育 25min。
2.推片染色、镜检。
正常值： NBT阳性细胞率应≥95%
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（二）巨噬细胞功能检测
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二、淋巴细胞亚群的分离
免疫磁珠分离法 流式细胞术分离法 其他方法
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免疫磁珠分离法
原理 将针对淋巴细胞特殊表面标志的某种特异性单克
隆抗体与磁珠结合形成免疫磁珠（IMB），当特异性 单克隆抗体与表达相应抗原的靶细胞结合，利用磁 场可以将IMB所结合细胞与其他细胞分离。包被磁珠 的抗体可以是第一抗体或第二抗体。
吞噬率＝（吞噬CRBC的Mф 数/计数的Mф 数）×100％
吞噬指数＝ Mф吞噬的CRBC总数/计数的Mф 数
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第二节 外周血单个核细胞的分离和纯化
PBMC包括：淋巴细胞、单核细胞 各种血细胞比重不同,利用密度梯度离心进行分
离 常用分层液：ficoll－hypaque，percoll
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二、相关功能检测
吞噬细胞的吞噬活动大体分为趋化、吞噬和胞内杀灭作 用三个阶段，据此建立相应的检测方法。 （一）中性粒细胞功能检测技术 （二）巨噬细胞功能检测技术
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（一）中性粒细胞功能检测
细胞趋化功能的检测 吞噬功能的检测 杀菌功能的检测
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趋化功能检测——检测细胞运动功能
体内试验法：皮肤窗法