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醋酸纤维素薄膜电泳

6.5~12
12~29
缓冲液pH=8.6
pI<pH
血清蛋白均带负电荷,在电场中向正极移动
在醋酸纤维素薄膜分为五条带。电泳迁移率最大的是白蛋 白,其后为α1球蛋白,α2球蛋白,β球蛋白和γ球蛋白
+
白蛋 α α β
γ
白(A) 1
2
实验器材
电泳仪,电泳槽,滤纸,醋酸纤维素薄膜 脱色摇床,染缸,点样器
血清中几种主要蛋白组分:
血清蛋白质 等电点
分子量
白蛋白 α1球蛋白 α2球蛋白 β球蛋白
4.8白 6.85~7. 50
69,000
200,000
300,000
90,000~ 150,000 156,000~ 950,000
占总蛋白的 %
57~72 2~5 4~9
步骤
4、平衡 将膜条无光泽向下置于电泳槽支架上
,点样端靠近负极。薄膜两端要紧贴滤纸,(点
样线不要压在滤纸上)中间平直悬空,加盖密封
,平衡5min。
5 、电泳
将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上 (点样面朝下),另一端平贴在阳极端支架上(见下图)。 要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直,中间不能下垂。连接好电泳 仪。在室温下电泳,打开电源开关,调节电流强度 0.5mA/cm膜宽度,通电50min后,调节旋钮使电流为零,关 闭电泳仪切断电源。
试剂
4x电极缓冲液:1.5mol/L Tris-HCl(pH 8.6)
(Tris三羟甲基氨基甲烷)
染色液:称取0.5g氨基黑,甲醇50ml,冰醋
酸10ml,蒸馏水加至100ml。
漂洗液:取甲醇45ml,冰乙酸5ml和蒸馏水
50ml,混匀置塞试剂瓶内贮存。
实验操作
1、准备 将电极缓冲液加入电泳槽的电极室内, 使正,负极室的液面等高,调节电泳支架宽度正好 适合醋酸纤维素薄膜的长度。用4层纱布或滤纸做 盐桥,一端浸入缓冲液中,一端搭在支架上。
意义
肝炎:白蛋白,a1-球蛋白,a2-球蛋白,β-
球蛋白下降,γ-球蛋白升高
肝硬化:白蛋白,a1-球蛋白,a2-球蛋白
下降明显, γ-球蛋白极度升高
肾病综合症:白蛋白降低,α2和β球蛋白
升高
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带正电荷的水层携带粒子向 负极移动
如果样品原本是移向负极的,则泳动的速度加快; 如果样品原本是移向正极的,则泳动的速度减慢。
电泳技术:指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。 电泳技术的优点:快速,准确,重复性好。 电泳分类: 按装置的差异有:薄膜电泳,垂直板电泳,平板电泳,垂直圆
等)
血清蛋白电泳结果的临床意义
可能相关疾病
白蛋白
α 1球蛋 α 2 球 蛋 β 球 蛋 γ 球 蛋




骨髓瘤

肾病综合症



肾炎


肝硬化
↓(显著)

急性肝坏死





传染性肝炎



急性感染初期



慢性炎症/感染

后期
低球蛋白血症

临床意义: 血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳在临床上 常用于分析血、尿等样品中的蛋白质,供临床上 诊断肝、肾等疾病参考。
有不同的等电点而带不同性质的电荷,因而在一 定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同, 即它们的电泳迁移率不同,因此,可对它们进行
分离。 电泳的应用:分离各种有机物;分析某种物质的
纯度及分子量。
影响电泳迁移率的因素:
1、内在因素:蛋白所带净电荷的性质和所带电 荷的多少、蛋白的大小和形状
2、外界因素:电场强度、溶液的pH值、溶液的 离 子强度和电渗现象
注意事项
1、薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。 2、点样时,应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去。 3、点样时,动作要轻、稳,用力不能太大,以免损坏薄膜
影响分离效果。
4、点样应点在薄膜的毛面上,点样量要适量,不宜过多或
过少。
5、电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端。 6、应控制染色时间。时间长,薄膜底色不易脱去;时间太
可以减少产热。所以,实验中我们要选择合适的电压,同时要冷

却降温。
离 3缓冲液的性质
效 缓冲液的pH决定了生物的解离程度。对于蛋白质和氨基酸来说,我们知
果 道溶液的pH离等电点越远,,所带的净电荷越多,迁移速度越快。因此选 择一个合适的pH,使各种蛋白质所带的净电荷数量差异越大,以利于分
的 离。缓冲液要求性能稳定,不易电解。 因 同时,缓冲液的离子强度会对自身缓冲能力有影响。过高,缓冲能力差,
短,着色不易区分,或造成条带染色不均匀,必要时可进行 复染。
7、每次电泳时应交换电极,使两侧电泳槽内缓冲液的正负
离子相互交换,使缓冲液的pH维持在一定水平。
电泳失败的原因
①电泳图不整齐(点样不均匀,温度过高等) ②各组分分离效果不佳(点样过多,电流过低
等) ③染色后蛋白区带中间着色浅(染色试剂不足
1 实验目的 2 实验原理 3 实验步骤 4 注意事项
实验目的
掌握电泳的基本原理,了解电泳仪, 电泳槽的基本结构和功能。 熟悉电泳的基本过程与定量方法。 熟悉血清电泳在临床诊断中的作用。
实验原理
1. 醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维素薄膜作为支 持物的电泳方法。
2. 血清中各种蛋白质的等电点在pH4.88~7.50之 间,在pH8.6的缓冲溶液中均带负电荷,在电场 中向正极泳动。血清中各种蛋白质的等电点不 同,所以带电荷量也不同。此外各种蛋白质的 分子大小各有差异,因此在同一电场中泳动的 速度不同。分子小而带电荷多者,泳动较快; 反之,则较慢。
盘电泳和毛细管电泳 按支持介质有: 1 醋酸纤维素薄膜电泳:分辨率高,成本低,灵敏度高,应用 广泛。 2 琼脂糖凝胶电泳:操作简单,分辨率高,重复性好,结果可 定量分析,电泳后易洗脱。 3 聚丙烯酰胺凝胶电泳;灵敏度高,对pH和温度变化较温度, 应用广。 4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳具有聚丙烯酰胺凝胶电泳的所有 优点。 5 等电聚焦电泳。 6 双向电泳:具有极高的灵敏度和分辨率。
素 过高则会阻碍分子的迁移,使样品速度减慢。
4支持介质
理想的介质:具有网状结构,不带电荷,对分离物质无 吸附作用的惰性材料。
网状结构:提高电泳分辨率 电渗:降低分辨率。导致电渗的原因是支持介质表面存
在带电基团。 吸附:降低电泳分辨率。(常用支持介质中,高纯度的
琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶的吸附最小,醋酸纤维素薄膜 次之,滤纸最大
2、浸膜
在膜条无光泽面距一端1.5cm处用铅笔轻划点样线,浸入电
极缓冲液中,至完全浸透为止(≧20min)。用镊子取出薄膜, 点样线向上平放于干净滤纸上,用滤纸轻轻地按压,吸去薄膜上 多余的液体。
3、点样
取少量待测血清均匀涂布在玻璃片上,用宽1cm的平整的塑
料软片末端取少许样品,垂直轻印到薄膜点样线上,形成一条 细窄而均匀的直线。(注:点样量不宜过多)此步是实验的关 键。以印章法加样时,点样量不宜过多,动作应轻,稳,用力 不能太重。
血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳
——第三组 陈艳 李秀清 张伟 孙金山
定义:带电粒子在电场中向着与其电性相反的电极移动 的现象。





那 么 什 么 是 电 泳?
电泳为何能分离混合物?
原理
迁移率(mobility):表示单位电场强度粒子的 速度。
又叫泳动度,用 μ表示。 μ=v/E=Q/(6πrη) 可知,在一定pH条件下,不同的蛋白质由于具

步骤

6、染色 取下薄膜直接浸于氨基黑10B染色
液中,染色5~10min。然后在漂洗液中漂去剩余染
料,直至背景无色为止。回收漂洗液。。
7、定量 将干燥的薄膜电泳图谱入自动扫描光密度
仪内,记录仪上自动绘出蛋白质组分曲线图。每一个 峰代表一种蛋白质组分。若使用具有电子计算机附件 的自动扫描光密度仪,可通过相关软件的分析,直接 获得每。 条区带蛋白质的百分含量。
5温度

热不利于电泳
热蒸发缓冲液,影响缓冲液的离子强度,甚至导致样品
变质。
热会增加样品的扩散
为了减少热对实验的影响,可控制电泳或电流,也可安
装冷却完散热装置。
: 电渗作用
电渗:在电场作用下液体对固体支持物相对移动的现象。
以纸电泳为例:
正极
-------- ++++++++
负极 表面带负电荷
等电点(pI)
以生物大分子为例
COO-
H+
Pr
OH- Pr
NH2
COO-
H+
Pr
OH-
NH3+
pH>pI
pH=pI
COOH
NH3+
pH<pI
1样品性质
影 响
迁移率与电荷量成正比,与相对分子质量成反比。
2电场强度
电 泳
电压越高,速度越快。但高电压 介质温度升高 样品扩散
和对流速度增加
分辨率降低。低电压会延长电压时间,但
蛋白质的染色方法
蛋白 质
1. 氨基黑10B :蓝色酸性染料,可与蛋白质结合 形成青色结合物。灵敏度为考马斯亮蓝R-250 的20%。
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