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技术流程
提出 生物学问题
实验组和对照组样品制备
双向电泳(2DE/DIGE)
凝胶图像分析
差异蛋白点选取 蛋白酶解及质谱分析 差异蛋白点的成功鉴定
Western blot 、蛋白质双向电泳的 原理、方法及在医学中的应用
湘雅医学院精神医学 1301班
CONTENTS
1
Western blot 原理及方法
2
蛋白质双向电 泳的原理
4
应用
3
蛋白质 双向电 泳的方
法
2
Western blot 原理及方法
蛋白质印迹法
3
Western blotting
? 做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题，一是所选抗体是否能识别 凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一个是所选抗体是否会引起交叉 反应条带 。
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化学显色法
方便、便宜、灵敏 度较低、费抗体、 反应慢、线性窄、 不易保存、不能重 新剥离检测
Western blotting ！！
4
什么是蛋白质印迹法 ？
Westernblot法 是凝胶电泳技术、固定化技术及分 子亲和技术三者融为一体的综合性技术，其核心在 于把凝胶已分离的区带并印迹于固化纸上，可分为 电泳、转印、酶免疫测定3个阶段。Westernblot法 结合了电泳的高分辨率和酶免疫测定的高敏感性和 特异性，是一种能用于分析样本组分的免疫学测定 的方法。
Western Blotting 间接法操作流程
Western Blotting 设计标准
分子量 标准
膜的选择
抗体
显色结果
不可小看“蛋白标准” --分子量标准的选择修Leabharlann 分子 量标准预染分子 量标准
分子量标准
预混分子 量标准
15
不可小看“蛋白标准” --分子量标准的选择
?预混分子量标准
高分子量标准 低分子量标准 宽分子量标准
异性抗体结
2.PVDF膜
灵敏度、分辨 率和蛋白亲和 力比常规的膜 要高，对蛋白 的吸附能力要 远远大于NC膜
3.尼龙膜
对核酸和蛋白 质具有很强的 结合能力，能 代替NC膜用于 分子印迹和杂
交实验。
选择膜的标准
选择标准
1.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合 蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）
2.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法， 信噪比好）
3.后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还 要根据不同目的来挑选不同的转移膜
膜的特点
抗体的选择
? 作为western 来讲，理论上单抗比多抗的特异性要好，但单抗种类较少 一般价格偏高，所以一般来说多抗足够了。 用于western 的抗体和用于 ELISA 的抗体，一般来说用于 western 的抗体识别的是氨基酸序列特异 性；而可用于 ELISA 的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特 异性，有些是识别构像特异性 。所以一般根据抗体说明书来确定。
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第一向：等电聚焦
第二向：SDS —PAGE 电泳
?聚丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺(Arc)和交联剂N,N-甲叉丙烯 酰胺(Bis)在加速剂N,N,N'—四甲基乙二胺（ TEMED）和催 化剂硫酸铵（AP）或核黄素的作用下聚合交联成三维网状 的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为PAGE。
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蛋白质双向电泳的方法
显色的 方法
化学发光法
灵敏、快速、节省抗 体、反应快、线性宽、 无害、特异性高、可 重新剥离检测
同位素法
灵敏度高、不安全 、环境污染、不方 便和半衰期短
荧光底物法
Krypton ?荧光底物
蛋白质双向电泳的原理
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双向电泳的实验原理
◆第一向：等电聚焦 ◆第二向：SDS—PAGE电泳
Edward M. Southern建立 了将DNA转移到硝酸纤维 素膜 （NC膜）上，并利 用DNA－RNA杂交检测特定 的DNA片段的方法
George Stark对电 泳后的蛋白质分子进 行印迹分析从而发明 western印迹技术
1975 1979 同年 最终
McMaster和Carmichael 对RNA进行印迹分析，发 明 Northern印迹技术
5
为什么要作蛋白质印迹实验 ？
1
研究一些体外的 蛋白质分子，寻 找目的蛋白是否 存在样品当中
2
不同的样品中检 查蛋白质的表达 情况，上调或下 调表达，如疾病 和正常的样品之 间的表达差异性
6
Western Blot 的基本原理
在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一 种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
?缺点：
? 1.免疫反应性降低 ? 2.无信号二级放大 ? 3.抗体标记费时昂贵 ,使用不方便
Western Blotting 方法二: 间接法
?优点：
? 1. 免疫特异性不受标记影响 ? 2. 信号放大灵敏度高（多个二抗结合位点） ? 3. 多种标记的二抗可供选择 ? 4. 可选择不同的Marker
?预染分子量标准
单色预染 多色预染
?修饰分子量标准
糖基化 磷酸化 荧光标记
预混分子量标准
? 高分子量标准 ? 低分子量标准 ? 宽分子量标准
预染分子量标准
? 单色预染 ? 多色预染
修饰分子量标准
? 糖基化 ? 磷酸化 ? 荧光标记
膜—三种选择
1.硝酸纤维素膜（NC 膜）
价格便宜，简单 快速封闭与非特
?缺点：
? 1. 交叉反应引起的非特异性条带 ? 2. 额外的二抗孵育以及条件优化
为什么一般情况下都采用间接法进行检测？
?直接法与用二抗的间接法相比有诸多不足，标记可用于很多种 不同特异性的一抗，避免了标记很多一抗的需要，同时因为一 抗结合不知一个二抗分子，所以二抗可以增强信号，所以一般 情况下都采用间接法进行检测
Western Blotting 操作流程
蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
转膜 封闭 一抗孵育 二抗孵育 底物显色
Western Blotting 操作流程
第三步
第五步
底物显色
第一步
一抗杂交
转膜
第二步
封闭
第四步
二抗杂交
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Western Blotting 方法一: 直接法
?优点：
? 1.快速（一种抗体） ? 2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带