微波-超声辅助协同萃取-高效液相色谱法测定新疆野蔷薇根中总皂苷的含量其买古丽·阿沙木，努尔皮达·阿卜拉江，迪丽努尔·马里克*（新疆师范大学化学化工学院,新疆乌鲁木齐840054）摘要：建立了用微波-超声辅助提取，高效液相色谱测定野蔷薇根中总皂苷的方法，以野蔷薇根总皂苷含量为考察标准，研究了提取时间、乙醇浓度、微波-超声功率、料液比这四个因素对总皂苷含量的影响。
该方法线性范围宽，检测限为0.3μg/L，平均相对标准偏差2.2%，加标回收率在99~104%之间。
结果表明，该方法的灵敏度高并且具有较好的重复性、准确性及稳定性。
关键词：野蔷薇根；总皂苷；超声；微波；HPLC法。
Determination of total saponins in Rosa multiflora Thunb by Microwave-ultrasonic assisted extraction -high performance liquid chromatography (HPLC)QIMANGUL·Hasan，NURPIDA·Ablajan，DILNUR·Malik(School of chemistry and chemical engineering xin jiang normol university，Urumqi 830054）Abstract： A microwave-ultrasonic assisted extraction-high performance liquid chromatography(HPLC) method for the determination of total saponins in Rosa multiflora Thunb was established ，Regarding the content of total saponins in Rosa multiflora Thunb as the index of investigation, the factors such as the extraction time, ethanol concentration, power of microwave, ratio of solid to liqud as affecting the content of total saponins were studied.Under the optimum extraction conditions,the method yields a good linearity and the low limits of detection are 0.3 μg/L.The recovery was between 99%～104% with relative standard deviation was2.2% . The results shown that the method has Good Repeatability, sensitivity ,stability and accuracy. Keywords: Rosa multiflora Thub; Total saponins; Ultrasonic; Microwave; HPLC 野蔷薇（Rosa multiflora Thub）属于蔷薇科蔷薇属植物，野蔷薇富含多种人体所需的营养物质[1-2]，有较大开发利用价值，现代研究证明，野蔷薇中含有熊果酸、齐墩果酸等三萜类化合物[3]。
三萜类化合物是自然界中一类重要化合物，*基金项目：国家自然科学基金（21165018）项目资助作者简介：其买古丽，女，（维吾尔族）硕士研究生，主要从事天然产物的研究。
联系作者：迪丽努尔.马里克（1964-），女，教授，主要从事天然产物研究。
（pkudilnur@）具有广泛的生理活性，有溶血、抗癌、解热、抗炎、镇痛、抗菌和抗病毒作用[4]。
总皂苷（Total saponins）是存在于植物界的一类比较复杂的苷类化合物，按其苷元结构可分为甾体皂苷和三萜皂苷。
它的分子式C30H48O3分子质量456，它具有溶血，止血，提高血小板内C AMP含量，降低血小板凝剂，降低血脂，清除血自由基，扩张冠脉，扩张血管，降低心肌耗氧量抗心律失常，抗炎，抗氧化，镇痛作用，抗纤维化，抗衰老，抗肿瘤，目前主要应用之中在心脑血管系统疾病何种去神经系统疾病[5]。
由于其广泛的生物学活性,近年来国内外对其提取、含量测定等方面进行了大量的研究工作[6-10]。
由于超声微波协同萃取与传统提取方法相比具有快速、高效、安全可靠、环保等优点，本实验采用超声微波协同萃取新疆野蔷薇根中总皂苷并且尝试利用HPLC方法对新疆野蔷薇根中总皂苷进行测定，HPLC方法简单、分离度好、精密度高、分析时间短，可用于实际样品的测定，对开发新疆野蔷薇有一定的参考价值。
1.试验材料，试剂与仪器1.1材料蔷薇根：采自阿勒泰县，粉碎，过筛，备用。
1.2 试剂齐墩果酸标准品（中国药品生物制品检定所），无水乙醇，甲醇（色谱纯），超纯水，乙腈（色谱纯）。
1.3 仪器高效液相色谱仪（安捷伦1200LC，美国）；色谱柱（安捷伦公司HC-C184.6×150mm,粒径为5μm）；XH300B型微波超声波组合合成∕萃取仪（北京样祥鹄科技发展有限公司生产）；SHZ_D(Ⅲ)型循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂生产)；RE_52AA型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂生产）；AL204型电子天平（梅特勒—托利多仪器有限公司生产）。
2．试验方法2.1.色谱条件AgilentHC-C18(4.6mm×150mm，粒径为5um）色谱柱，分别选取流动相乙腈-水，甲醇-水，乙腈和酸度不同的去离子水，同时对不同流速，不同控制温度进行实验。
2.2标准溶液的配制、线性范围及最低见出线精密称取干燥至恒重的齐墩果酸对照品2.4mg置于10ml容量瓶中,，加甲醇定容至刻度，摇匀得浓度为0.24mg/ml的对照品储备液，置于冰箱中密封保存。
准确量取储备液用甲醇定容，配成不同浓度的溶液，即0.024mg/ml，0.048mg/ml，0.096mg/ml，0.144mg/ml，0.192mg/ml，0.24mg/ml超声处理30min，并用0.45μm 微孔滤膜过滤，待仪器进行使用。
并测定出最低检出限。
2.3野蔷薇根样品前处理准确称取粉碎后的野蔷薇根5g于100mL圆底烧瓶中，在一定料液比、溶剂浓度、温度、功率、提取时间等条件下微波超声波组合合成∕萃取仪提取一定时间，取出过滤，将滤渣重复提取2次后过滤，合并3次所得滤液进行减压浓缩。
将浓缩溶液分别放入25mL容量瓶用甲醇定容至刻度，取上清液用0.45μm微孔虑膜过滤，待仪器进行使用。
2.4 样品回收率实验选用在空白样品中添加齐墩果酸标准溶液的浓度0.17mg/ml，每个加标水平重复5次，测定总皂苷的回收率。
2.5正交试验因素水平设计根据已有的资料和实际情况，试验选用提取时间、乙醇浓度、微波-超声功率、料液比作为考察因素，采用L9(34)正交表进行优选。
正交试验各因素水平如表1 所示。
表1 因素水平表Table1 factors level table水平A提取时间/min B料液比(g/mL) C功率/w D乙醇浓度/％1 10 1:10 400 852 20 1:15 500 903 30 1:20 600 953, 结果与分析3．1 色普条件的优化最佳波长的选择：在206～380nm 下，对48ug/ml的齐墩果酸进行扫描，结果选择254nm 为实验最佳吸收波长，该色谱条件下可以降低最小检测量。
HPLC 分离条件的确定：流动相由乙腈和水（0.01%磷酸水溶液）组，因为使用乙腈能更快的获得极限的稳定，改善峰形，缩短出峰时间。
如用乙腈-水作流动相不能获得很好的峰形而且峰托尾，改用0.01%磷酸水溶液-乙腈作流动相可以峰形较大改善。
随着酸性的加大峰形更好，但酸度过高对色谱柱造成损伤。
因此以乙腈–去离子水（0.01%磷酸水溶液）选为流动相，即乙腈：水=12：88 。
根据已有的资料和实际情况（柱子温度对分离度影响较小），结果柱温选为30℃，流速0.8mL/min。
综上所述，高效液相色谱操作条件确定为：流动相乙腈：水=12：88，流速0.8mL/min，紫外检测波长254nm，柱温30℃，进样量为20μl。
在该色谱条件下齐墩果酸标准品的色谱图（如图1），保留时间为3.39min。
图1 对照品色谱图Figure 1 reference substance chromatogram图2 样品色谱图Figure 2 sample chromat3．2 回归方程、相关系数与检出限取6种不同浓度的标准溶液，即0.024、0.048、0.096、0.144、0.192、0.24mg/ml，依次进样20μL ，在选定色谱条件下对每个质量浓度进行3次测定，以峰面积为纵标，对照品浓度为横坐标做标准曲线(见图3)，得回归方程：y=36617.8008x-194.58907 ，相关系数R2=0.998。
线性范围0.024～0.24mg/ml 。
按照仪器振动峰3倍的峰可以计算出齐墩果酸的浓度，该浓度成为检出限，检出限为0.3ug/l 。
图3 齐墩果酸标准品工作曲线Figure 3 oleanolic acid standard product work curve3. 3加样回收率选用在空白样品中添加齐墩果酸标准溶液的浓度0.17mg/ml，每个加标水平重复5次，测定野蔷薇跟中总皂苷的回收率和标准偏差，结果如表2所示，样品加标色谱图见图2表2回收率与精密度Table 2 recovery rate and prec样品测定量加入量测出总量回收率/％ RSD/％(n=5) 1.91 1.02 2.94 100.11.92 1.022.96 101.91.91 1.022.92 99.0 2.21.90 1.022.94 101.91.94 1.02 3.01 1043．4 正交试验结果以齐墩果酸提取率为指标，对表1 所选定的考察因素做L9(34)正交试验，其结果见表3。
由试验结果并通过极差R的大小可知,各试验因素对总皂苷提取率影响的大小次序为：C>A>D>B，即对野蔷薇根中总皂苷提取影响最大的因素是微波-超声提取功率,其后依次为微波-超声提取时间、乙醇浓度和料液比。
最佳提取条件是：C3A3B1D2，微波-超声提取时间30min，乙醇浓度90%，功率600w，料液比1:10表2L9(34)正交试验设计及结果。