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第十二章 微生物工程生产举例


二、抗生素生产工艺
1、生物合成法: ③细胞融合技术法 对抗生素产生菌采用细胞融合技术的成果更 为突出。橄榄色无孢小单孢菌细胞融合株抗生素 产率比原菌株提高100倍。 目前DNA重组技术已广泛用于红霉素、链霉 素等20多种抗生素的育种工作,可以预见不久将 来会有更多的由“工程菌”生产的新型抗生素问 世。
二、氨基酸(赖氨酸)生产工艺
重点: 赖氨酸生物合成途径及代谢调节机制; 酵母和霉菌的赖氨酸生物合成途径和调 节机制; 赖氨酸生产菌的育种途径。 难点:天冬氨酸族氨基酸生物合成的代谢调 节机制。
二、氨基酸生产工艺
氨基酸本身的合成在不同生物体中,有较大的差异, 然而许多氨基酸的合成途径在不同生物体中也有共同之处。 按照起始物可将氨基酸的合成分成几个家族: ㈠谷氨酸族(α -酮戊二酸族) 包括:谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸和脯氨酸; ㈡丙酮酸族 包括:丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸; ㈢天冬氨酸族(早酰乙酸族) 包括:天冬氨酸、天冬酰胺、苏氨酸和异亮氨酸; ㈣磷酸甘油酸族 包括:甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸; ㈤芳香族 包括:苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸; 另外,组氨酸的合成为单独的一条途径。
三、青霉素生产工艺
3、发酵条件控制 补糖:残糖降至0.6%(PH上升); 补氮:氨氮0.05%,补硫铵、氨水或尿素; PH:6.4—6.6,加糖、加酸、加碱调节; 温度:前期,25-26℃;后期, 23℃; 通气比:1:0.8; 溶氧:﹥氧饱和溶解度的30%; 消沫剂:玉米油、豆油或化学合成消沫剂。
苏氨酸脱水酶受异亮氨酸的反馈抑制; 添加前体物质D-苏氨酸、α-酮基异戊酸; 绕过异亮氨酸对苏氨酸脱水酶的反馈抑制。
直接发酵法:
抗反馈调节突变株,解除对苏氨酸脱水酶的 反馈抑制。
3、亮氨酸发酵
亮氨酸高产菌株的选育:
1)选育α-酮基异丁酸抗性突变株,解除对异亮氨 酸、亮氨酸和缬氨酸生物合成酶系的阻遏作用; 2)选育异亮氨酸缺陷型回复突变株, 其α-异丙基 苹果酸合成酶不再受亮氨酸的反馈抑制; 3)α-噻唑抗性兼蛋氨酸、异亮氨酸双重缺陷型突 变株,用于亮氨酸的发酵生产。
3、酵母和霉菌的赖氨酸生物合成途径
就赖氨酸合成途径来讲,不同种类的 微生物途径不同,可以归纳为两条途径: 1)为经过二氨基庚二酸的生物合成途 径,如细菌、DPA; 2)是AAA,酵母菌、霉菌经过α -氨基己 二酸AAA途径合成赖氨酸。
4、氨基酸生物合成的调节机制
反馈抑制与优先合成
氨基酸生物合成的基本调节机制有反馈抑制与 在合成途径分支点处的优先合成。 反馈抑制:A→B→C→D
5)增加前体物的生物合成和阻塞产物的生成:
方法:
①选育丙氨酸缺陷型; ②选育抗天冬氨酸结构类似物突变株; ③选育适宜的活性比突变株;
6)改变细胞膜的透过性 7)选育温度敏感突变株 8)应用细胞工程和遗传工程育种 9)防止高产菌株回复突变
7、赖氨酸生物合成途径
大肠杆菌的赖氨酸生物合成途径:图23-2
8、赖氨酸发酵条件控制
溶氧:特别重要,不足,会使赖氨酸 生产受到不可逆抑制; PH:通过补加氨水来控制; 温度:32℃; 前体:甘氨酸或丝氨酸。(短小假单胞菌)
三、异亮氨酸、亮氨酸生产工艺
1、异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸的生物合成途径:
图23-4
2、异亮氨酸发酵
两种方法:添加前体发酵法和直接发酵法 添加前体发酵法:

工业上重要氨基酸简介
一、氨基酸生产工艺控制
1、菌种:细菌,野生型或营养缺陷型、结 构类似物突变菌种; 2、培养基: 碳源:淀粉水解糖、糖蜜等; 氮源:铵盐、氨水或尿素,豆饼、麸皮粉; 无机盐:S、P、Ga、Mg、K等; 生物素:影响细胞膜透性,对氨基酸分泌影 响很大,来源:玉米浆、麸皮、糖蜜。
一、氨基酸生产工艺控制
二、抗生素生产工艺
1、生物合成法: ② “工程菌”制造法
第一次由“工程菌”制造的全新抗生素—麦迪紫红 素 A,是美国报道的。他们将产放线紫红素的部分基因插入 产麦迪霉素的放线菌中,构建的“工程菌”产生了全新 的抗生素。 我国新构建的生产丁胺卡那霉素的“工程菌”,就 是把 酰化酶基因克隆到卡那霉素产生菌中获得的。采用新的 “工程菌”生产,避免了现国外通用的使用有毒光气生 产的 办法,新抗生素毒副作用小,对耐卡那霉素、庆大霉素
在细菌中,虽然天冬氨酸族氨基酸生物合成途 径是相同的,但是其代谢调节机制是多种多样的。 1)大肠杆菌K12 ①天冬氨酸激酶 ②天冬氨酸-β -半醛脱氢酶 ③DDP合成酶(赖氨酸分支的第一个酶) ④高丝氨酸合成酶(HD)(通向苏氨酸、蛋氨酸分 支的第一个酶)
2、天冬氨酸族生物合成的代谢调节机制
2)黄色短杆菌 其赖氨酸生物合成调节机制比大肠 杆菌简单,其天冬氨酸激酶只有一种, 该酶具有两个变构部位,可以与终产物 结合,当两种终产物同时过量时,该酶 活性受到抑制。 3)乳糖发酵短杆菌赖氨酸合成调节
第三节 柠檬酸生产工艺
重点:柠檬酸生物合成途径;柠檬酸生物 合成的代谢调节;三羧酸循环的调节。 难点:柠檬酸生物合成的代谢调节;糖酵 解及丙酮酸代谢的调节。
一、柠檬酸发酵生产工艺
(一)柠檬酸合成途径 柠檬酸又名枸橼酸,学名α -羟基丙烷三羧 酸,是生物体主要代谢产物之一。 柠檬酸合成途径: 丙 EMP 葡萄糖 酮 酸
三、青霉素生产工艺
三、青霉素生产工艺
三、青霉素生产工艺
1、菌种:产黄青霉 生长发育分六个阶段: Ⅰ—Ⅳ期:菌丝生长期,适宜做种子; Ⅳ—Ⅴ期:青霉素分泌期; Ⅵ期:菌丝体自溶期。
三、青霉素生产工艺
2、培养基: 碳源:乳糖、蔗糖、葡萄糖等; 氮源:玉米浆、麸皮粉、无机氮源; 前体:苯乙酸或苯乙酰胺;(一次﹤0.1%) 无机盐:S、P、Ga、Mg、K等。 铁离子有害, 控制在﹤30µg/ml。
二、抗生素生产工艺
2、化学合成法 根据某种抗生素的化学组成和结构, 通过化学合成的方法,可生产部分抗生素。 如:氯霉素、磷霉素等。 经过化学合成方法和控制条件的不断 深入研究,越来越多的抗生素可用化学合 成法生产。
二、抗生素生产工艺
3、生物合成加化学合成法
许多细菌逐渐出现了抗药性,已经证实某些抗药性 因子位于细菌内的质粒上,质粒可以在细菌之间转移, 结果抗性菌日益增多,抗生素疗效就越来越低。 为了对付细菌的抗药性,科学家对原有的抗生素进 行了“整容手术”,细菌因再无法识别改头换面的抗生 素而 被抑制或杀死。 现在已能使用克隆了酰化酶基因的“工程菌”(大肠 杆 菌)高效率的生产半合成抗生素。临床现在使用的贵重 特效药物先锋霉素(头孢菌素类)、氨苄青霉素,就是 这类半合成抗生素类药物。国外已有几十种这类药物在 实验室研制成功。
解除代谢互锁的方法:
①选育亮氨酸缺陷型菌株,或者以抗AEC的赖氨酸的生产菌 为出发菌株,经诱变得到抗AEC兼抗亮氨酸缺陷型菌株。 ②选育抗亮氨酸结构类似物的突变株,从遗传上解除亮氨酸 对DDP合成酶的阻遏。 ③选育对苯醌或喹啉衍生物敏感菌株,这是一种寻找亮氨酸 渗漏缺陷型菌株的有效方法。
6、赖氨酸生产菌的育种途径
氨基酸的生物合成
1、天冬氨酸族生物合成途径
天冬氨酸族氨基酸合成可以以草酰乙酸或天冬氨 酸为原料,合成苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸。
天冬酰氨 甲硫氨酸 琥珀酰高丝氨酸 →异亮氨酸 DDP合成酶 二氨基庚二酸→赖氨酸 合成酶
草酰乙酸→天冬氨酸→天冬氨酸磷酸→天冬氨酸-β -半醛→高丝氨酸→苏氨酸
2、天冬氨酸族生物合成的代谢调节机制
E
D
优先合成:A→B→C F G
5、其他特殊的控制机制
1)终产物控制
催化分支合成途径共同部分的初始酶, 在仅一种氨基酸终产物过剩时,完全不受或微 弱或部分地反馈抑制(或阻遏),只是在多数 终产物共存下才强烈地控制。有以下几种情况: ①协同(或多价)反馈抑制 ②合作(或增效)反馈抑制 ③同功酶控制 ④积累反馈抑制
氧化脱羧
乙酰COA
→柠檬酸 草酰乙酸
羧化
(二 )柠檬酸生物合成的代谢调节
1、糖酵解及丙酮酸代谢的调节
1)在正常情况下,柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶 有抑制作用,而ATP、无机磷、铵离子对该酶 则有激活作用,特别是还能解除柠檬酸、ATP 对磷酸果糖激酶的抑制作用。 2)比较底物锰充足、锰缺乏时分批培养物的最 大活力时发现,锰缺乏时黑曲霉的组成(合成) 代谢受损伤,这与柠檬酸的积累有关。 3)丙酮酸激酶是EMP途径的第2个调节点,在某 些真菌得到证实,但黑曲霉未被证实。
三、青霉素生产工艺
4、青霉素的分离纯化 过滤:板框、真空转鼓; 萃取:醋酸丁脂,2-3次; 脱色:活性碳,150-200g/10亿单位; 结晶:浓缩结晶或直接结晶; 洗涤 干燥
第二节 氨基酸生产工艺
一、氨基酸生产工艺控制 二、氨基酸生产工艺 三、异亮氨酸、亮氨酸生产工艺
概 述
氨基酸可用作食品、饲料添加剂和药物。过去都采用 动植物蛋白提取和化学合成法生产,现18种氨基酸均可 采用发酵法和酶法生产,不仅成本下降、污染减少,还 可组织大量生产,世界产量每年递增5%~10%。 在氨基酸产生菌选育中,过去多采用诱变育种方法, 诱变结果不易控制,现采用基因工程和细胞融合技术, 产量可成倍、甚至几十倍增加,生产成本大大下降。 如用基因重组构建的苏氨酸、色氨酸“工程菌”,比 原 始菌株提高产量几十倍(产酸达50~60克/升),色氨酸 成本从每公斤50美元降到23美元。用细胞融合构建的精 氨酸融合株,精氨酸产量达108克/升,比其他生产菌株 高2倍多。
一、抗生素的分类
按生物来源、作用、化学结构、作用机制、合 成途径可分为:表22-1
二、抗生素生产工艺
生产方法:
1、生物合成法: ①传统方法 ② “工程菌”制造法 ③细胞融合技术法 2、化学合成法; 3、生物合成加化学合成法。
二、抗生素生产工艺
1、生物合成法: ①传统方法 大多数抗生素是由放线菌和霉菌产生的。菌 种是通过从土壤中分离、筛选获得,一般采用深 层通风搅拌发酵罐生产。 传统方法目前存在很多不足,因此,人们采 用基因工程和细胞融合技术,对抗生素产生菌进 行了改造和重新设计,不仅可以制造出许多高效 低毒的新型抗生素,还可改革工艺,使抗生素产 量成倍地增长。
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