体外连接法快速高效构建表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒载体作者：王家宁, 王传成郭凌郧, 黄永章[摘要] 目的: 采用体外连接法构建和制备重组腺病毒Adeno-X-LacZ，为构建具有治疗价值的重组腺病毒载体奠定基础。
方法: PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ酶切pShuttle2-LacZ穿梭质粒，回收4.6 kb 的LacZ基因表达盒，与经过相同酶切的Adeno-X病毒DNA连接，连接产物用SwaⅠ酶切，最终产物转化DH5α。
重组质粒用PCR法和PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ酶切鉴定。
pAdeno-X-LacZ用PacⅠ线性化后，用脂质体介导其转染至AD293细胞内包装扩增出重组腺病毒颗粒，采用CsCl 密度梯度离心法纯化重组腺病毒Adeno-X-LacZ。
采用X-gal染色观察Adeno-X-LacZ在AD293细胞内包装和HVSMC表达情况。
结果: PCR扩增可见312 bp特异性条带，PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ酶切重组质粒后释放出4.6 kb LacZ基因表达盒。
X-gal染色证实了在AD293细胞内成功扩增包装出重组腺病毒Adeno-X-LacZ和LacZ基因在HVSMC中得到有效表达。
结论: 体外连接法是一种快速、简便、高效的构建重组腺病毒质粒的方法，本研究为构建具有治疗价值的重组腺病毒奠定了基础，Adeno-X-LacZ为研究腺病毒介导的基因转移提供了一良好的对照载体。
[关键词] 体外连接;腺病毒;β－半乳糖苷酶;PI-SceⅠ;I-CeuⅠAbstract: Objective To construct recombinant adenoviral v ector expressing β-galactosidase by in vitro ligation and provide a basis for construction of recombinant adenovirus vector expressing therapeutic gene of interest.Methods pShuttle2-LacZ was digested with PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰand 4.6 Kb fragment of LacZ gene expression cassette was recovered .This fragment was ligated to predigested Adeno-X viral DNA with PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ. The ligated product was digested with Swa Ⅰ.The resultant DNA was transformed into E. Coli. DH5α.The correct recombinant plasmid, pAdeno-X-LacZ ,was identified by PCR and PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰdigestion. The Pac I-digested, linearized pAdeno-X-LacZ was transfected into AD293 cells by Lipofectamine. Recombinant adenovirus , Adeno-X-LacZ, was purified with CsCl density gradient ultracentrifugation. HVSMC was infected with Adeno-X-LacZ. X-gal staining was performed to monitor the expression of β-galactosidase gene. Results There was a specific band of 312bp when pAdeno-X-LacZ was amplified by PCR. PI-SceⅠ/I-CeuⅠdigestion of pAdeno-X-LacZ released 4.6Kb of LacZ gene fragment. X-gal staining confirmed Adeno-X-LacZ was packaged successfully within AD293 cells and the expression of β-galactosidase gene in HVSMC. Conclusion In vitro ligation is a simple, rapid and efficient method for constructing recombinant adenoviral vector. This study provides a basis for construction of recombinant adenoviral vector carrying therapeutic gene of interest, Adeno-X-LacZ is also a useful control vector for the research of gene transfer mediated by recombinant adenovirus.K ey words: In vitro ligation; Adenovirus; β-galactosidase; PI-Sce Ⅰ; I-Ceu Ⅰ重组腺病毒载体具有转染效率高，感染细胞范围广，病毒滴度高，可感染细胞周期中静止期和分裂期细胞，同时可高效介导基因的体内外转移。
因而腺病毒载体是目前后基因组时代基因功能研究和基因治疗研究普遍运用的载体[1-6]。
但腺病毒载体的构建是一项费时费力具有挑战性的工作。
过去细胞内同源重组方法构建和制备携带目的基因的重组腺病毒，由于同源重组率低和需要对重组体进行多轮费时费力的筛选鉴定，限制了重组腺病毒载体在研究中的应用[7-8]。
细菌内同源重组法构建和制备重组腺病毒，由于操作相对复杂以及需要两种特殊的大肠杆菌（BJ5183, XL10-gold），使得构建重组腺病毒的效率相对低下[9-13]。
本研究介绍体外连接方法构建和制备表达β－半乳糖苷酶的重组腺病毒载体，为构建重组腺病毒载体建立一新的技术平台，为构建携带目的基因的重组腺病毒载体奠定基础。
1 材料和方法1.1 主要材料BD Adeno-X Expression system（购自BD Biosciences Clontech公司）包括Adeno-X Viral DNA(PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ已消化)，pShuttle2穿梭质粒（含有多克隆位点及PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ酶切位点），pShuttle2-LacZ,PI-Sce Ⅰ和I-Ceu Ⅰ内切酶，Adeno-X扩增引物(Forward primer:5’-TAGTGTGGCGGAAGTGTGATGTTGC-3’; Reverse primer: 5’-TCGACCATAGGGGATCGGGAGATC-3’)。
X-gal（Sigma公司产品），Lipofectamine 2000（Invitrogen公司产品），λDNA/HindⅢ marker(华美生物工程公司产品)，DH5α为本研究所保存，SwaⅠ（New England Biolabs公司产品）。
LigaFast Rapid DNA ligation sysrem（Promega 公司产品）。
AD293细胞（Stratagene公司）。
1.2 主要仪器高速冷冻离心机（Hettich,Universal 32R，德国），超速冷冻离心机（Hitach，CP80MX，日本），紫外/可见光分光光度计（Cecil，CE2041，英国），倒置相差显微镜（Nikon，TE2000-U，日本），二氧化碳培养箱（Binder，德国），超净工作台（苏净集团安泰公司），超低温冰箱（-80 ℃，Sanyo，日本），凝胶图像分析系统（Touching 995 gel document system，天呈科技公司）。
1.3 构建策略见图1。
1.4 携带LacZ基因的重组腺病毒质粒pAdeno-X-LacZ的构建pShuttle2-LacZ用PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ酶切后进行低熔点琼脂糖凝胶电泳，回收4.6 kb含LacZ基因的表达盒。
将回收片段与预先用PI-Sce Ⅰ/I-Ceu酶切的Adeno-X Viral DNA采用快速连接体系连接。
将连接产物用Swa Ⅰ酶切，以去除腺病毒骨架质粒自身环化和酶切不完全所引起不携带LacZ基因片段的质粒。
将Swa Ⅰ酶切后的产物用酚/氯仿抽提，纯化连接产物。
将纯化后的连接产物转化感受态DH5α，将其铺于含氨苄青霉素（100 μg/ml）的LB平板上37 ℃倒置培养24 h。
挑选菌落扩增，采用碱裂解法小量抽提质粒，用PCR方法和PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ酶切鉴定重组质粒是否携带有LacZ基因表达盒。
若携带有LacZ基因表达盒的重组腺病毒质粒采用PCR扩增后则出现一特异性312 bp片段，采用PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ双酶切后会出现一4.6 kb的片段。
1.5 Lipofectamine 2000介导pAdeno-X-LacZ转染AD293细胞取20 μg pAdeno-X-LacZ用Pac 酶切37 ℃过夜，采用酚/氯仿抽提酶切片段，乙醇沉淀，高压三蒸水溶解，加50 μl Lipofectamine 2000脂质体，室温30 min，置4 ℃保存备用。
AD293细胞培养于25 cm2塑料培养瓶，待60％融合时，进行转染。
弃培养液，用PBS洗1次，加4 ml 10％FCS.DMEM培养液，加入预先准备好的DNA/脂质体复合物至培养瓶中，每3 d换培养液1次，观察细胞病变情况，至AD293细胞80％出现病变时收集细胞，37 ℃/-80 ℃反复冻融3次，12 000 g离心10 min，收集上清。
1.6 重组腺病毒的扩增、纯化及滴度测定[14]取原代重组腺病毒上清，反复感染AD293细胞，37 ℃ 5％ CO2培养箱中培养，镜下观察到出现95％~100％病变时，收集细胞，以5 000 g 离心，弃上清，沉淀重悬于适量PBS中，在37 ℃/-80 ℃反复冻融3次，以12 000 g离心收集上清，按照文献方法对重组腺病毒上清进行CsCl密度梯度离心纯化[14]，并将纯化后的腺病毒在透析液中（10 mmol/L Tris・HCl，1 mmol/L MgCl2，10%甘油）4 ℃透析2次，每次24 h。