（2） 20mmol/L磷酸苯二钠溶液：先将500mL蒸 馏水煮沸，迅速加入磷酸苯二钠2.18g，冷却后加 氯仿2ml防腐，在4℃冰箱内保存。用剩的溶液不 应再倒回瓶中。 （3）铁氰化钾液：分别称铁氰化钾2.5g，硼酸17g， 各溶于400ml蒸馏水中，二液混合后，加蒸馏水至 1L。棕色瓶中避光保存。如出现蓝绿色，说明试剂 变质，应弃去。 （4）酚标准工作液(0.05mg/ml)：购买合格的二级 标准品。
(磷酸苯二钠法)
掌握血清碱性磷酸酶测定的临床意
义 熟悉血清碱性磷酸酶活性的测定方 法 掌握酶活性测定的一般方法
碱性磷酸酶(ALP)是一组在碱性环境中水解磷酸酯 酶类，ALP广泛分布于人体各脏器器官中，其中以 肝脏为最多其次为骨骼、肠等组织。正常人血清中 ALP主要来源肝脏，少部分来自骨骼。血清中ALP 活力测定可用于肝胆疾病及骨骼系统疾病的辅助诊 断，是临床常开展的酶类检测项目之一。 酶活力 ： 酶催化某一化学反应的能力，其衡量的 标准是酶促反应速度的大小。 酶促反应速度： 常用单位时间内底物的减少量或产 物的生成量来表示。
(一)器材 5mL移液管 、1mL 移液管、100 μL或200 μL微 量可调式移液器、721E型分光光度计、1cm比色 皿、37 ℃恒温水浴锅。 (二)试剂 (1) 0.1mol/L碳酸盐缓冲液(pH=10.0)：称取无 水碳酸钠6.36g 、碳酸氢钠3.36g 、 4-氨基安替 比林1.5g，溶于800mL蒸馏水中，定容至1L，置 于棕色瓶中贮存。
计算公式
ALP活性金氏单位定义：每100ml血清在37℃ 与底物作用15分钟，产生1mg为1金氏单位。 ALP活性=(AT-AC)/(AS-AB)×0.05×100(金氏单
位)
参考值
成人：3~13金氏单位；儿童：5~28金氏单位。
(1)血清ALP活力升高的可能原因如下。①肝胆疾病： 阻塞性黄疸、肝炎、肝硬化、肝癌等； ②骨骼疾病： 由于骨的损伤或疾病使成骨细 胞内所含高浓度的 ALP释放进入血液中，引 起血清ALP活性增高，如纤 维性骨炎、成骨 不全症、佝偻病、骨软化病、骨转 移癌和 骨折愈合期等。 (2)血清ALP活性减低可见于呆小症，重症慢性肾炎、 乳糜泻、贫血、恶病质等。还有一种遗传性低ALP症， 此种婴儿血清ALP缺乏，成骨细胞中也缺乏此酶，引 起骨中的矿物质严重缺乏，易发生骨折。



（1）铁氰化钾溶液中加入硼酸有稳定最后所显红 色的作用。此液应避光保存，如出现蓝绿色即作废。 （2）目前市售的酚标准液多数为安瓿装，开后不 能久置。本法呈色较稳定，因此用标准曲线更为方 便。 （3）底物液中不应含有酚，如含有酚时空白管显 红色，说明磷酸苯二钠已开始分解，不宜继续使用。 否则可因底物浓度降低，酶反应不完全而致结果偏 低。 （4）加入铁氰化钾后必须迅速混匀，否则显色不 充分。
实验操作
取试管四支，按下表操作
T S B C 血 清(ml) 0.1 — — — 酚标准液(ml) — 0.1 — — 蒸馏水(ml) — — 0.1 — pH10磷酸盐 1.0 1.0 1.0 1.0 缓冲液(ml) 混匀。37℃水浴保温5分钟，同时将底物 液预热 底物液(ml) 1.0 1.0 1.0 1.0 混匀。37℃水浴保温5分钟 铁氰化钾溶液 3.0 3.0 3.0 3.0 (ml) 血 清(ml) — — — — 立即混匀。用510nm波长比色，以蒸馏水调零点，读取各法)：通常是酶作用一段时间后， 加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应测 定这段时间内底物的减少量或产物的生成量，计 算酶促反应的平均速度。 动力学分析法（连续监测法）：在酶促反应过程 中，用仪器连续监测酶促反应产物或底物的变化 量，通过计算求出酶活力。

在pH=10环境中，ALP催化磷酸苯二钠水解生成酚 和磷酸。酚在碱性溶液中与4-氨基安替 比林作用， 经铁氰化钾氧化生成醌衍生物。可根据红色深浅测 定酶活性的大小。反应式如下：

酶活性单位：指在规定的条件下,酶促反应在单位生 成一定量的产物或消耗一定量的底物所需要的酶量。 国际单位（IU）：在特定条件下，1min内将 1μmol底物转化为产物所需的酶量为1个国际单位。 Kat单位：在特定条件下，每秒钟转化1mol底物的 酶量。（1 IU=16.67 ×10-9Katal） 常用单位：活性测定方法的建立者所规定的单位。 一般是在规定的反应条件和反应时间中，产物的生 成量来表示。如碱性磷酸酶活力单位Kings定义， 即每100mL血清在37℃时与底物作用15min,产生 1mg苯酚的酶量为1个Kings 单位。