一、RT-PCR快速诊断方法（一）生物安全要求（二）病毒核酸提取（三）RT-PCR（四）PCR 产物纯化（五）流感病毒RT-PCR检测引物二、免疫荧光方法检测流感病毒（一）原理（二）标本处理（三）间接免疫荧光法（四）结果判断三、实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）快速诊断检测（一）基本原理（二）实验试剂（三）实验步骤四、快速诊断试剂盒流感的快速检测方法，与传统的病毒分离鉴定相比具有快速、简便的特点。

因此常用于流感暴发时早期病原学检测用。

流感的快速诊断包括直接和间接免疫荧光法、ELISA、RT-PCR、Real-Time PCR快速诊断速方法、流感快速诊断试剂盒等。

这里介绍RT-PCR、Real-Time PCR、免疫荧光快速诊断速诊断方法和几种流感快速诊断试剂盒优缺点。

无论那种快速诊断都无法代替传统的病毒分离鉴定方法。

一、RT-PCR快速诊断方法核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组的有力方法，即使基因组含量很低或死病毒也可以检测到。

本章将介绍检测流感病毒的聚合酶链式反应（PCR）。

流感病毒的基因组是负链RNA，在进行PCR扩增前必须合成与病毒RNA互补的DNA，即为cDNA。

逆转录酶（RT）就是用于合成cDNA的多聚酶，因此，扩增流感病毒基因组的过程称为RT-PCR。

RT-PCR需要一对型别特异引物，四种脱氧核苷酸（dNTPs），RNA模板，逆转录酶及Taq DNA 多聚酶；首先由逆转录酶将病毒的RNA逆转录合成cDNA，然后再进行聚合酶链反应经25～30个循环，使DNA产物达到倍增的效果。

（一）生物安全要求生物安全级别与个人防护要求：生物安全二级实验室，防护要求与二级实验室的要求相同。

并应遵守相应的生物安全规定。

进行高致病性禽H5 RT-PCR快速检测时可以在生物安全二级实验室里进行，核酸提取在生物安全三级实验室的生物安全柜里完成。

（二）病毒核酸提取1.实验材料及仪器(1)QIAGEN公司的Rneasy Mini Kit（Catalog# 74104）(2)β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol）(3)70% 乙醇(4)无菌离心管(5)10μl、20μl、200μl、1000μl加样器和枪头(6)可调14K微型离心机(7)旋转混合器2.操作步骤(1)取1支无菌、无RNA酶的 Eppendorf管，加入500μl RLT。

(2)取采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或细胞培养液）100μl，加入上述Eppendorf管中。

(3)加5μl β-巯基乙醇，充分混匀。

(4)加600μl 70%乙醇，于旋转混合器混匀。

(5)从试剂盒中取出带滤膜的离心柱，并标上标本号。

(6)将第4步的混合液体分两次（每次600μl）吸入于滤柱中，12000rpm离心15秒，弃收集管中的离心液。

(7)滤柱仍放回收集管上，将第4步的混合液全部吸入滤柱中，12000rpm 离心15秒，弃收集管中液体。

(8)于滤柱中加入700μl RW1，12000rpm 离心15秒。

(9)从试剂盒中取出一支新的2ml收集管，将离心后的滤柱转到新的收集管上，于柱子中加入500μl RPE，12000rpm 离心15秒弃收集管中液体。

(10)滤柱放回收集管上，于滤柱中加入500μl RPE，13000～14000rpm 离心2分钟。

(11)从试剂盒中取出一支 Eppendorf管，将滤柱转到新的管上，于滤柱中加入30～50μl 无RNA酶的水，室温静置1～3分钟。

(12)12000rpm 离心1分钟，弃滤柱。

收集的离心液即为提取病毒的RNA，可以直接用于逆转录实验，或在-20℃以下保存，-30℃可保存3～4个月。

3.注意事项(1)试剂盒中的RPE液用前需加44ml无水乙醇，使终体积达到55ml。

(2)所有用过的枪头、收集管放入2%次氯酸钠消毒缸中过夜。

（三）R T-PCR1.一步法 RT-PCR(1)实验材料1)QIAGEN One Step RT-PCR Kit Cat No 2102122)RNase inhibitor 40u/μl（Promega）3)上游引物200ng/μl4)下游引物200ng/μl5)模板RNA（Templet RNA）(2)实验步骤1)PCR反应配置（在清洁区缓冲间，加RNA模板应在核酸室）无RNA酶水（Rnase Free Water）μl5×Buffer 10μl10mM dNTP 2μlEnzyme Mix 2μlRnase inhibitor μl上游引物1μl下游引物1μlRNA 模板5μl总量：50μl2)将PCR 反应管放入PCR扩增仪3)RT-PCR 反应条件：此循环的反应条件仅共参考，如果引物更换，相应的反应条件需要做适当调整。

60℃ 1 min42℃ 10 min50℃ 30 min95℃ 15 min94℃ 30 sec52℃ 30 sec72℃ 1 min返回第 5部，循环34次72℃ 10 min4℃ 保存4)PCR产物检测琼脂糖凝胶配置：用1×TBE 将琼脂糖配成%～%溶液，加热使之完全溶解。

冷却到50～60℃时加入溴化乙锭（Ethidium Bromide EB，10ug/μl），终浓度为μg/ml。

PCR产物检测：将凝胶放入电泳槽,加入1×TBE Buffer ，使它淹没过胶面。

每份标本取4μl PCR产物，与1μl 5×Loading Buffer 充分混匀后全加入凝胶孔中。

于同一凝胶的第一孔加入5μl分子量标准样品。

加完样后，盖上电泳槽盖子，接通电源，稳压100v，电泳时间约30～40min。

结果分析：用UV～254暗箱式紫外透射仪观察电泳结果，在透射波长254nm 下观察结果效果较好。

或者用凝胶成像系统观察电泳结果。

5)注意事项：含EB的琼脂糖经处理后放入科研垃圾袋内统一处理。

含有EB的凝胶处理方法：加1倍体积的L KMnO4,小心混匀。

加入1倍体积的 mol/L HCl,小心混匀。

于室温放置数小时。

加入1倍体积的 mol/L NaOH,小心混匀后即可丢弃。

2.二步法 RT-PCR(1)实验材料1)逆转录酶：AMV Reverse Transcriptase，Catalog# M5101 Paromeg2)5×RT Buffer3) 2.5mM dNTP4)Rnase inhibitor 40u/μl（Promega）5)上游引物200ng/μl6)下游引物200ng/μl7)无RNA酶的水（Rnase Free Water）8)Ex-Taq 酶5u/μl DRR 001A 250u （Takara）9)10×PCR Buffer(2)实验步骤1)逆转录反应（在清洁区缓冲间，加RNA模板在核酸提取室）无RNA酶的水μl5×RT Buffer 4μl2.5mM dNTP 2μl上游引物1μlRnase inhibitor μl逆转录酶1μlRNA 模板5μl总量：20μl将上述反应液混匀，42℃水浴作用1小时。

然后94℃ 3min ，放置冰上（下步PCR反应或-20℃ 待用）2)PCR反应配置（在清洁区缓冲间，加cDNA模板应在PCR扩增室）无RNA酶的水μl10×PCR Buffer 5μl2.5mM dNTP 2μl上游引物1μl下游引物1μlEx-Taq 酶μlcDNA 模板5μl总量：50μl3)将PCR 反应管放入PCR扩增仪4)PCR 反应条件：此循环的反应条件仅共参考，如果引物更换，相应的反应条件需要做适当调整。

94℃ 3 min94℃ 40 sec52℃ 40 sec72℃ 2 min返回第2部，循环30 次72℃ 7 min4℃ 保存PCR 产物检测：同一步法（四）P CR 产物纯化1.实验材料QIAquick Gel Extraction Kit Cat No 287042.操作步骤(1)PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳；(2)用干净的手术刀切割目的DNA片段，将切下的DNA胶放入离心管（切胶在暗箱或紫外透射仪下操作）；(3)加3倍胶体积的Buffer QG（即100mg DNA胶加300μl Buffer QG）；(4)水浴50℃孵育10min，直到DNA胶完全溶解（每隔2～3min 用旋转混合器混匀）；(5)加一个胶体积的异丙醇（100mg DNA胶加100μl异丙醇）；(6)从试剂盒中取出带滤膜的离心柱收集管，并标上标本号；(7)将上述DNA液吸入带滤膜的离心柱，13000rpm离心1min，弃收集管中废液，再将带滤膜的离心柱放回收集管；(8)于带滤膜的离心柱中加 Buffer QG，13000rpm离心1min，弃收集管中废液；(9)带滤膜的离心柱中加入 Buffer PE，放置2～5min，13000rpm离心1min，弃收集管中废液，再将带滤膜的离心柱放回收集管上，13000rpm离心1min；(10)将带滤膜的离心柱转移到一新的离心管上；(11)于带滤膜的离心柱中加20～30μl TE（或Rnase Free Water），室温3～5min，12000rpm离心1min，弃小柱，收集的离心液即为纯化的PCR产物，可直接用于测序。

（五）流感病毒RT-PCR检测引物A型检测引物：5’ CCG,AGA,TCG,CAC,AGA,GAC,TTG,AAG,AT5’ GGC,AAG,TGC,ACC,AGC,AGA,ATA,ACTB型检测引物5’ GGG,ACA,TGA,ACA,ACA,AAG,ATG5’ TGT,CAG,CTA,TTA,TGG,AGC,TGH1亚型鉴定引物5’ ACT,ACT,GGA,CTC,TGC,TGG,AAC5’ CAA,TGA,AAC,CGG,CAA,TGG,CTC,CH3亚型鉴定引物5’ ATC,AGG,GAG,AGT,CAC,AGT,CTC5’ ATG,CTT,CCA,TTT,GGA,GTG,ATG,CH5亚型鉴定引物5’ GAG,TGA,AGC,CTC,TCA,TTT,TG5’ GTA,CTT,CTT,GGT,TGG,TAT,TAT,TGT,ACG,TCCH5亚型鉴定引物5’ GGG,TGA,GCT,CAT,GTA,CA5’ YTG,AGT,CCC,CTT,TCT,TGAH5亚型鉴定引物5’ GCC,ATT,CCA,CAA,ACA,CCC5’ CT C,CCC,TGC,TCA,TTG,CTA,TGN1鉴定引物5’ AAG,GGG,TTT,TCA,TAC,AGG,TAT,GGT5’ TCT,GTC,CAT,CCA,TTA,GGA,TCCN2鉴定引物5’ GGA,AAT,CGT,TCA,TAT,TAG,CCC,ATT,G5’ AGC,ACA,CAT,AAC,TGG,AAA,CAA,TGC二、免疫荧光方法检测流感病毒（一）原理流感病毒主要感染呼吸道上皮细胞，因此在病人呼吸道标本的脱落细胞中含有流感病毒抗原，通过直接检查上皮细胞内病毒特异性抗原即可诊断。