荧光定量PCR引物设计专业的定量PCR设计软件beacon Designer 有时一对100分的引物扩增效率特别低换了一对貌似很烂的引物结果溶解曲线却长得很漂亮扩增效率也蛮高。
个人认为这个跟你选择的位置有关看引物Tm值相差是否很高适当降低反应退火温度看看是否有效看所扩增片段GC含量以及产物Tm是否很高比方水稻基cDNA扩增常常用到GC buffer。
看所用扩增基因是否为组织特异性表达看RNA是否完整是否降解反转录过程是否完整设好内参正对照最后所有这些都满足还是没扩增出来重新设计引物吧1设计的时候尽量靠近基因的3端这样能最大限度地保证扩增效率2尽量跨越内含子这样可以保证检测有无基因组污染3两条引物的Tm值不要相差太大4产物长度保证在80200bp之间最长300 bp。
.如果想同时检测很多对基因的变化最好设计的时候记录下产物的Tm值这对你后面的实验设计读板温度很有帮助。
保证在产物Tm80以上一般Tm80以下的峰都是引物二聚体对于水稻等GC含量比较高的基因组产物Tm不要高于94个人观点。
如果同时检测很多对基因的表达量变化我会尽量调整所有产物的Tm值与内参产物的Tm相差不太大这样方便实验操作和最后的分析。
3相对错配来说我认为dimer和harpin对realtime PCR的影响更大当然也别错配得太邪门了非来一条跟产物出峰在相同位置或者比产物峰还高的错配就死了引物的3端不要有错配。
5一般我们用Primer Premier设计软件我一般先让软件自动搜索正义链或反义链的引物找到一条评分是100的再在它左右合适的位置手动搜索有没有合适和它配对的评分也比较高的引物一般5分钟之内可以搞定一个基因。
实时定量PCR引物设计的具体要求1、引物应用核酸系列保守区设计并具有特异性。
最好位于编码区5端的300-400bp区域内可以用DNAMANAlignment软件看看结果。
2、不能形成2级结构。
3、引物长度一般在17-25bp之间上下游引物不能相差太大。
4、GC含量在40-60之间45-55最佳。
5、碱基要随机分布尽量均匀。
6、引物自身不能有连续4个碱基的互补。
7、引物之间不能有连续4个碱基的互补。
8、引物5�6�7端可以修饰。
9、3�6�8端不可修饰而且要避开ATGC rich的区域避开T/C A/G连续结构2-3个。
10、引物3端要避开密码子的第三位。
11、引物整体设计自由能分布5端大于3�6�7端。
12、定量产物长度80-150bp最好最长是300bp。
实时定量PCR完全手册方法简介所谓的实时荧光定量PCR 就是通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。
在实时荧光定量PCR 反应中引入了一种荧光化学物质随着PCR 反应的进行PCR 反应产物不断累计荧光信号强度也等比例增加。
每经过一个循环收集一个荧光强度信号这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化从而得到一条荧光扩增曲线。
广义概念下的定量PCR技术可以分为五种类型1外参法终产物分析。
所谓“外参法”是指样本与阳性参照在两个反应容器内反应。
这种类型没有对样本进行质控监测易出现假阴假阳结果没有监测扩增效率定量不准。
2内参法终产物分析。
所谓“内参法”是指样本与阳性参照在一个反应容器内反应。
这种类型对样本进行质控监测排除假阴结果但是定量不准。
3外标法过程监测。
这种类型监测扩增效率阳性样本定量准但是无法排除假阴结果。
4内参法过程监测。
由于样本与阳性参照在一个容器内反应用同样的Taq酶和反应参与物存在竞争性抑制起始模板量浓度高的反应会抑制起始模板量浓度低的反应所以定量不准。
5外标法过程监测内对照。
这种类型监测扩增效率阳性样本定量准同时排除假阴结果。
这种类型是应该提倡的。
在国家没有出台阴阳判定标准时所用PCR系统灵敏度最好达到一个拷贝一个病毒。
从理论上说只要有一个拷贝数样本就算阳性一个拷贝数都没有才算阴性。
所谓的实时荧光定量PCR 就是通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。
在实时荧光定量PCR 反应中引入了一种荧光化学物质随着PCR 反应的进行PCR 反应产物不断累计荧光信号强度也等比例增加。
每经过一个循环收集一个荧光强度信号这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化从而得到一条荧光扩增曲线。
PCR过程的监测有多种检测模式。
最常用的有三种检测模式1R Green I 检测模式。
温度循环为94—55—72°C三步法只有引物无探针荧光染料镶嵌在双股螺旋链中间。
通过对特定方向的强荧光检测获得信号这种试剂检测模式易产生非特异信号且本底光较大。
2解探针模式TaqmanHydrolysis Probe 。
温度循环为94—60°C二步法不仅有引物还有另外一个特异针对扩增模板的探针在引物对之间。
在探针相邻两个碱基上分别结合两个荧光染料一个染料接受激发光得到的能量传给了第二个染料接受能量的第二个染料通过发射特征光子回到稳定态。
当Taq酶在60°C延伸扩增链时遇到探针利用Taq酶5—3外切酶活性将探针水解成单个碱基单个碱基之间距离较远第一个染料的能量无法传给第二个染料只好通过发射特征光子回到稳定态通过对溶液中第一个染料的荧光检测获得信号。
这种试剂检测模式增加了检测信号的特异性但是由于利用了Taq酶5—3外切酶活性一般试剂厂家只给Taq酶的聚合酶活性定标没有同时给Taq酶5—3外切酶活性定标不同批号试剂之间会给定量带来差异。
另外对探针的熔点温度Tm仅要求其高于60°C这就使不同试剂盒之间的特异性参差不齐而且无法做质控检测。
3杂交探针Hybridization Probes模式。
温度循环为94—55—72°C三步法有引物二个特异针对扩增模板相邻的探针在引物对之间在一个探针3碱基上结合一个荧光染料在另一个探针5碱基上结合第二个荧光染料。
在55°C时两个探针都刚好接合在模板上第一个染料接受激发光得到的能量传给了第二个染料接受能量的第二个染料通过发射特征光子回到稳定态通过对结合在扩增模板上双探针中第二个染料的荧光检测获得信号。
这种试剂检测模式中荧光信号与特定杂交温度相关探针的浓度始终保持不变因此可以在扩增后检测熔解曲线作为信号的特异性质控。
另外这种试剂检测模式可以用于点突变检测。
RT-qPCR是由三个步骤组成: 1.反转录:依赖反转录酶将RNA 反转录成cDNDA 2.扩增:用PCR的方法扩增cDNA 3.检测:实时检测和定量扩增的产物. RT-qRCR影响分析可靠性关键点Key porint: 1.分析结果依赖于模板的数量、质量以及合理的检测方法设计 2.反转录反应的非标准化影响试验的稳定性3.数据分析应该高度客观如果不合理的分析从分析结果中会得到混淆的错误结果因此通过对RT-qPCR的每一组分进行质量评价以达到最小化变异性最大化可重复性而且还需要沿用一个通用的数据分析的指南。
对基因表达分析的标准化的需要是与人类临床诊断分析相适应的。
存在的问题由于各个学术团体和科研机构使用不同的操作流程必然导致大家使用不同定量的来源物以及数据分析 1.新鲜、冰冻、甲醛固定的样品 2.整个组织样本显微切割样本单个细胞组培细胞 3.总RNA或者mRNA 4.RNA反转录成cDNA的不同的引发策略 5.不同的酶以及酶的不同组合6.变异系数、灵敏度7.多类型的检测化学方法反应的条件热循环仪的分析以及汇报方式。
8.每一步骤缺乏标准化分析流程造成了在样品的处理内参的使用归一化的方法质量控制等等因素严重影响RT-qPCR的可信度重复性。
RNA 质量评价现在RNA 定量的程序很多。
最近EMBO qPCR coursehttp://www-db.embl.de/jss/EmblGroupsOrg/conf_28 比较了用Ribogreen Agilent BioAnalyser spectrophotometerNanodrop and the BioRad Experion 来定量同样的样品。
结果显示没有哪两种方法得到同样的分析数据。
所以用不同的方法进行定量是不明智的。
因此我们需要用统一套定量分析方法来完成所有RNA样品的评价。
RNA 质量RNA 质量主要包括RNA的纯度没有蛋白质和DNA的污染以及完整性。
传统的RNA质量的评价通过分析A260/A280的比值或者对琼脂糖凝胶电泳rRNA的条带的分析。
Agilent Bioanalyser/BioRad Experion 微流体毛细电泳系统也是一种较新的分析方法。
Agilent的2100也是一种十分好的分析RNA质量的方法它通过分析18S以及28S rRNA的分析图谱通过图谱来反应RNA 的量和完整性其完整性通过完整性系数RIN来反应。
样品的RINs在10-4之间。
10代表完整的RNA4代表没有完整的rRNA带。
由于以上的方法并非100准确定反应mRNA的完整性因为他们只是反应rRNA的量来间接测定mRNA的完整性。
这里推荐一种方法采用GAPDH的3�6�85�6�8分析法。
我们使用oligo dT进行逆转录然后对逆转录的cDNA 用multiplex荧光定量评价。
设计三个taqman探针来定量三种相同大小的扩增产物。
探针设计的位点分别位于3�6�85�6�8以及中部。
扩增产物的之间的比值反应RNA 的完整性。
如果3�6�85�6�8的比值在1反应较高度完整性如果高于5说明降解。
QRT-PCR 抑制物的组成QRT-PCR抑制物严重减少了PCR的灵敏度以及热动力学反应高度的抑制还导致假阴性的结果。
抑制物的来源生物样品的核酸抽提以及共沉淀中的混合物盐离子尿素血红素heparin以及IgG. 是否有抑制物的评价体系1.通过对目的样品进行梯度稀释进行PCR扩增效率的检测 2.通过内部扩增对照来反应样品处理过程中样本的情况 3.用细菌检测临床样品的抑制4.通过标准人工合成的扩增进行RT-PCR来反应目标检测物的抑制情况反转录反应系统 1.RT和PCR单一酶系统 2.RT和PCR分离的酶系统3.RNA逆转录引物的选择引物主要有三种1.随机引物随机引物特别是6nt引物对所有的靶位点不产生十分稳定一致的结果建议使用15nt 的随机引物. 2.oligo-dT只能用于mRNA完整的样品特别有polyA .而且对于一些特殊的变异体以及较长的3�6�8UTR 的区域比较困难 3.特异引物最特异最灵敏的方法。
特别RNA量足够情况下建议使用此法。
PCR 优化PCR优化主要有1.引物的浓度2.建议使用SYBR Green I和EvaGreen进行扩增和溶解曲线的测试笔者建议的操作流程: 一靶的选择和试验设计 1.针对目的基因序列选择合适的扩增片断查看以下三个网站是否有合适的已经证实的QRT-PCR的扩增引物探针以及反应条件. RTPrimerDBhttp://medgen.ugent.be/rtprimerdb 相对物种较多PrimerBank /primerbank/index.html 人鼠Real Time PCR Primer Sets 人mouserat 如果没有合适的或者已经证实的可以提供参考以下的设计方案仅供参考: A.最广泛使用的商业化的软件Beacon Designer B.DIY的软件Primer Express C.如果Beacon Designer 无法得到您说需要的结果或者获得到设计方案的备选数目不够的话可以选择Sigma-Genosys 的服务方案详细周到 D.一个免费的基于网页构架的引物和探针设计程序: /products/probe_design.asp.您可以挑选其中的4-6对引物进行试验选择引物的扩增效率和灵敏度高的.这个软件可以直接与NCBI的网站进行比对并且用NCBI的ePCR进行虚拟的电子PCR 引物设计简介DNA引物长度:15-25 个碱基GC含量:50左右如果引物的与AT区域富集结合可以考虑用LNA替换几个碱基较少引物的长度以及避免引物次级结构和3�6�8端二聚体的影响.由于引物和模板和探针与靶点之间的分之间的相互竞争分之内杂交倒转重复等等会引起引物的引发探针对结合效率降低因此我们选择引物二聚体的△G为负值即:。