双酶切连接反应之全攻略1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照：双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。
应用大体系，如100微升。
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。
所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。
我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒 酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。
而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的 因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的 质量好，酶切完全切得动。
2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算: 很多人凭经验也可以。
但对于初学者从头认真计算则 非常有必要。
回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bpDNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为 0.03×5.38×0.66=0.106524µg。
测DNA浓度: 可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER 进行估测，如MARKER2000，5微升的 MARKER每个条带约50ng。
连接反应：TAKARA的 连接酶上的 说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。
而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。
连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。
时间3个小时足已。
3、转化：a、全量（10 μl）加入至100 μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。
b、42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。
c、加入890 μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。
取100μl铺板。
也可离心后余100μl几个非常重要的问题1 做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见,一般连接3小时,16度.2. 对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时,注意加AMP时的温度,温度过高,会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。
铺板前后注意用吹风机吹干3. 对照的设立：为验证双酶切是否成功,可做如下对照:酶切反应时加各单酶分别切,两管,用同一种BUFFER,跑胶,看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功.做转化时,也要进行对照.设4个:A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应,这个对照可进一步看双酶切是否成功,如果长出克隆,说明很有可能只进行了单酶切,如没长出克隆,则证明双酶切成功,当然要保证感受态,培基,连接酶都'正常'的情况下.B.酶切过的未进行连接反应的双酶切产物,进行转化,这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒C.设原始质粒为对照,意为检测整个操作过程中是否有误.D.AMP阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够,检测感受态状况.4.所有的试剂切记低温保存.一步一个脚印.不要偷懒,图省事最后却更费事.注意设立对照。
经PCR鉴定，克隆90%-100%的阳性率，所以在后面的 挑克隆中，我只挑选4个就足够了。
然后双酶切鉴定，测序。
希望大家不断补充。
连接前最好将水、插入片段和载体混合好以后置于45度水浴5min，马上置于冰上冷却，再加入buffer和ligase。
分子克隆3的经典操作，个人认为主要目的如下：插入片段和载体在之前的操作过程中有部分粘性末端已经匹配，如果直接连接可能会有多重插入和多载体自连的情况，45度处理是其粘性末端打开。
由于片段与载体混合、预热后马上置于冰上，使得片段与载体最大限度匹配，从而提高连接效率。
刚才查了一下分子克隆3，只说了一句“以消除重新复性而导致的末端相互聚合”（中文版p71）。
下面简要的说一下对照的结果。
A 只长出了3个克隆，以100的基数计算，约为3%。
即双酶切反应中质粒只有3%进行了单酶切B 约有5个克隆，即质粒完全没被切动的约5%。
C 长了很多克隆，证明操作系统没有问题。
为系统控制指标。
D 长了很多克隆，证明感受态没有问题。
这些对照相辅相成，扬长避短。
万一什么都没作出来，也好分析原因。
To access your account, log inor register .shopping cart | log inRequest Technical SupportEnzyme Finder NEBcutter NEBuffer Chart Double Digest Finder Isoschizomers DNA Sequences and Maps REBASEHome > Technical Reference > Restriction EndonucleasesCleavage Close to the End of DNA Fragments (linearized vector)Linearized vectors were incubated with the indicated enzymes (10 units/µg) for 60 minutes at therecommended incubation temperature and NEBuffer for each enzyme. Following ligation and transformation, cleavage efficiencies were determined by dividing the number of transformants from the digestion reaction by the number obtained from religation of the linearized DNA (typically 100-500 colonies) and subtracting from 100%. "Base Pairs from End" refers to the number of double-stranded base pairs between the recognition site and the terminus of the fragment; this number does not include the single-stranded overhang from the initial cut. Since it has not been demonstrated whether these single-stranded nucleotides contribute to cleavage efficiency, 4 bases should be added to the indicated numbers when designing PCR primers. Average efficiencies were rounded to the nearest whole number; experimental variation was typically within 10%. The numbers in parentheses refer to the number of independent trials for each enzyme tested (from Moreira, R. and Noren, C. (1995), Biotechniques , 19, 56-59).Note: As a general rule, enzymes not listed below require 6 bases pairs on either side of their recognition site to cleave efficiently.| A | B | E | H | K | M | N | P | S | X |Enzyme Base pairs from End%Cleavage Efficiency Vector Initial CutAatII3 2 188 (2) 100 (2) 95 (2) LITMUS 29 LITMUS 28 LITMUS 29 NcoI NcoI PinAI Acc65I2 199 (2) 75 (3) LITMUS 29 pNEB193 SpeI SacI AflII 113 (2)LITMUS 29StuI AgeI1 1100 (1) 100 (2) LITMUS 29 LITMUS 29 XbaI AatII ApaI 2100 (1)LITMUS 38SpeI AscI 197 (2)pNEB193BamHI AvrII 1100 (2)LITMUS 29SacI BamHI 197 (2)LITMUS 29HindIII BglII 3100 (2)LITMUS 29NsiI BsiWI 2100 (2)LITMUS 29BssHII BspEI2 1100 (1) 8 (2) LITMUS 39 LITMUS 38 BsrGI BsrGI BsrGI2 199 (2) 88 (2) LITMUS 39 LITMUS 38 SphI BspEI BssHII 2100 (2)LITMUS 29BsiWI EagI 2100 (2)LITMUS 39NheI EcoRI1 1 1100 (1) 88 (1) 100 (1)LITMUS 29 LITMUS 29 LITMUS 39XhoI PstI NheIEcoRV1100 (2)LITMUS 29PstIHindIII 321 90 (2)91 (2)0 (2)LITMUS 29LITMUS 28LITMUS 29NcoINcoIBamHIKasI 21 97 (1)93 (1)LITMUS 38LITMUS 38NgoMIVHindIIIKpnI 221 100 (2)100 (2)99 (2)LITMUS 29LITMUS 29pNEB193SpeISacISacIMluI299 (2)LITMUS 39EagI MunI2100 (1)LITMUS 39NgoMIV NcoI2100 (1)LITMUS 28HindIII NgoMIV2100 (1)LITMUS 39MunINheI 12 100 (1)82 (1)LITMUS 39LITMUS 39EcoRIEagINotI741 100 (2)100 (1)98 (2)Bluescript SK-Bluescript SK-Bluescript SK-SpeIKspIXbaINsiI 332 100 (2)77 (4)95 (2)LITMUS 29LITMUS 29LITMUS 28BssHIIBglIIBssHIIPacI176 (3)pNEB193BamHI PmeI194 (2)pNEB193PstIPstI 321 98 (1)50 (5)37 (3)LITMUS 29LITMUS 39LITMUS 29EcoRVHindIIIEcoRISacI199 (2)LITMUS 29AvrIISalI 321 89 (2)23 (2)61 (3)LITMUS 39LITMUS 39LITMUS 38SpeISphISphISfiI941 81 (2)97 (2)93 (2)LITMUS 38LITMUS 38LITMUS 38BamHIMluIEcoRISpeI 22 100 (2)100 (2)LITMUS 29LITMUS 29Acc65IKpnISphI 221 99 (1)97 (1)92 (2)LITMUS 39LITMUS 39LITMUS 38SalIBsrGISalIXbaI 11 99 (2)94 (1)LITMUS 29LITMUS 29AgeIPinAIXhoI197 (2)LITMUS 29EcoRIXmaI 22 98 (1)92 (1)pNEB193pNEB193AscIBssHIITo access your account,log in or register .shopping cart | log inRequest Technical SupportEnzyme Finder NEBcutter NEBuffer Chart Double Digest Finder Isoschizomers DNA Sequences and Maps REBASEHome > Technical Reference > Restriction EndonucleasesCleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides)To test the varying requirements restriction endonucleases have for the number of bases flanking their recognition sequences, a series of short, double-stranded oligonucleotides that contain the restriction endonuclease recognition sites (shown in red) were digested. This information may be helpful when choosing the order of addition of two restriction endonucleases for a double digest (a particular concern when cleaving sites close together in a polylinker), or when selecting enzymes most likely to cleave at the end of a DNA fragment.The experiment was performed as follows: 0.1 A 260 unit of oligonucleotide was phosphorylated using T4 polynucleotide kinase and γ-[32P] ATP. 1 µg of 5´ [32P]-labeled oligonucleotide was incubated at 20°C with 20 units of restriction endonuclease in a buffer containing 70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl 2, 5 mM DTT and NaCl or KCl depending on the salt requirement of each particular restriction endonuclease. Aliquots were taken at 2 hours and 20 hours and analyzed by 20% PAGE (7 M urea). Percent cleavage was determined by visual estimate of autoradiographs.As a control, self-ligated oligonucleotides were cleaved efficiently. Decreased cleavage efficiency for some of the longer palindromic oligonucleotides may be caused by the formation of hairpin loops. | A | B | C | E | H | K | M | N | P | S | X |Enzyme Oligo SequenceChain Length% Cleavage 2 hr 20 hr AccI G GTCGAC C CG GTCGAC CG CCG GTCGAC CGG8 10 120 0 00 0 0AflIII C ACATGT G CC ACATGT GG CCC ACATGT GGG8 10 120 >90 >900 >90 >90AscI GGCGCGCC A GGCGCGCC T TT GGCGCGCC AA8 10 12>90 >90 >90>90 >90 >90AvaI C CCCGGG G CC CCCGGG GG TCC CCCGGG GGA8 10 1250 >90 >90>90 >90 >90BamHI C GGATCC G CG GGATCC CG CGC GGATCC GCG8 10 1210 >90 >9025 >90 >90BglII C AGATCT G GA AGATCT TC GGA AGATCT TCC8 10 120 75 250 >90 >90BssHII G GCGCGC C AG GCGCGC CT TTG GCGCGC CAA8 10 120 0 500 0 >90BstEII G GGT(A/T)ACC C9010BstXI AACTGCAGAA CCAATGCATTGGAAAACTGCAG CCAATGCATTGG AACTGCAGAA CCAATGCATTGG ATGCAT 222427252550>90ClaI C ATCGAT GG ATCGAT CCC ATCGAT GGCCC ATCGAT GGG881012>9050>9050EcoRI G GAATTC CCG GAATTC CGCCG GAATTC CGG81012>90>90>90>90>90>90HaeIII GG GGCC CCAGC GGCC GCTTTGC GGCC GCAA81012>90>90>90>90>90>90HindIII C AAGCTT GCC AAGCTT GGCCC AAGCTT GGG810121075KpnI G GGTACC CGG GGTACC CCCGG GGTACC CCG81012>90>90>90>90MluI G ACGCGT CCG ACGCGT CG8102550NcoI C CCATGG GCATG CCATGG CATG8145075NdeI C CATATG GCC CATATG GGCGC CATATG GCGGGGTTT CATATG AAACCCGGAATTC CATATG GAATTCCGGGAATTC CATATG GAATTCCC810121820227575>90>90NheI G GCTAGC CCG GCTAGC CGCTA GCTAGC TAG8101210102550NotI TT GCGGCCGC AAATTT GCGGCCGC TTTAAAATAT GCGGCCGC TATAAAATAAGAAT GCGGCCGC TAAACTATAAGGAAAAAA GCGGCCGC AAAAGGAAAA 121620242810102525101090>90NsiI TGC ATGCAT GCACCA ATGCAT TGGTTCTGCAGTT 122210>90>90>90PacI TTAATTAAG TTAATTAA CCC TTAATTAA GG8101225>90PmeI GTTTAAACG GTTTAAAC CGG GTTTAAAC CCAGCTTT GTTTAAAC GGCGCGCCGG8101224752550>90PstI G CTGCAG CTGCA CTGCAG TGCAAA CTGCAG AACCAATGCATTGGAAAA CTGCAG CCAATGCATTGGAACTGCAG AACCAATGCATTGGATGCAT81422242610>90>9010>90>90PvuI C CGATCG GAT CGATCG ATTCG CGATCG CGA81012102510SacI C GAGCTC G81010SacII G CCGCGG CTCC CCGCGG GGA81250>90SalI GTCGAC GTCAAAAGGCCATAGCGGCCGCGC GTCGAC GTCTTGGCCATAGCGGCCGCGGACGC GTCGAC GTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA 28303210105075ScaI G AGTACT CAAA AGTACT TTT81210752575SmaI CCCGGGC CCCGGG GCC CCCGGG GGTCC CCCGGG GGA68101210>90101050>90SpeI G ACTAGT CGG ACTAGT CCCGG ACTAGT CCGCTAG ACTAGT CTAG81012141010>90>905050SphI G GCATGC CCAT GCATGC ATGACAT GCATGC ATGT81214102550StuI A AGGCCT TGA AGGCCT TCAAA AGGCCT TTT81012>90>90>90>90>90>90XbaI C TCTAGA GGC TCTAGA GCTGC TCTAGA GCACTAG TCTAGA CTAG8101214>907575>90>90>90XhoI C CTCGAG GCC CTCGAG GGCCG CTCGAG CGG8101210102575XmaI C CCCGGG GCC CCCGGG GGCCC CCCGGG GGGTCCC CCCGGG GGGA81012142550>9075>90>90产品价目表产品资料 订货说明各地代理NEB 新产品 技术资料NEBcutter HOME限制性内切酶技术资料综述怎样建立酶切反应质量控制限制性内切酶识别序列的十字索引内切酶活性表内切酶37°C下的活性内切酶PCR反应中的活性内切酶的稀释兼容性双酶切反应内切酶在反应中的存活性内切酶的热失活星号活性甲基化酶改变内切酶识别性寡核苷酸近末端位点的酶切线性载体近末端位点的酶切切割超螺旋DNA单链DNA的切割Dam、Dcm和CpG甲基化(新)CpG甲基化对内切酶的影响E.coli的dam/dcm甲基化酶切割后片段的平均长度创造新的酶切位点琼脂糖包埋法切割DNA位点优势效应大分子DNA图谱遗传标记NEB提供的菌株其他E.coli菌株基因型遗传密码表氨基酸结构DNA碱基对结构核酸数据同位素酸碱蛋白质数据常见质粒中的基因产物寡核苷酸近末端位点的酶切(Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides))为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。