各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷 酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。
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平头末端： II型酶切割方式的另一种是在同一位臵上切割双 链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位臵是： 5’…… GAT|ATC …… 3’ 3’…… CTA|TAG …… 5’ 切割后形成
反应体系： 载体 DNA 100ng 插入片段DNA 17ng 连接酶 10X 缓冲液 1μl T4 DNA 连接酶 (Weiss 单位) 0.1–1u 无核酸酶水加至 10ul 2. 孵育反应于：室温下3 小时，或4°C 过夜，或15°C，4–18 小时。
实验步骤与试剂（酶切）
反应体系 1. 质粒pUC18 DNA 2. PCR产物 3. HindⅢ内切酶 4. Hind Ⅲ 10 X buffer 2μl 2μl 2μl 2μl

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五、注意事项——限制性内切酶酶切
３．反应缓冲液： 反应缓冲液主要由Tris· HCl、NaCl、Mg2+组成，其中Mg2+为 内切酶辅基； Tris· HCl维持反应体系pH值在7.2-7.6之间； NaCl浓度不同形成３种级别的离子强度： 低盐（10mM NaCl) 中盐（50mM NaCl） 高盐（100mM NaCl） 不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。

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连接反应---连接酶（ligase）
ligase 又称合成酶，能催化两个分子连接成一个分子或 把一个分子的首尾相连接的酶。此反应与ATP的分解反应 相偶联。在把两分子相连接的同时发生三磷酸腺苷（ATP) 的高能磷酸键的断裂如DNA连接酶等
连接酶的催化反应过程需要Mg离子
各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷 酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。
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一、DNA的限制性酶切实验原理

核酸限制性内切酶是一类能识别双链ＤＮＡ中特定 碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中 发现，功能犹似高等功物免疫系统， 用于抗击外来 ＤＮＡ侵袭。 限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯 键， 产生的ＤＮＡ片段５’端为Ｐ，３’端为ＯＨ。
5. ddH2O
反应步骤 1. 37°C
12μl
总体系为20 μ l，混匀 酶切2h
2. 65°C
灭活10min
3. 琼脂糖电泳检测
限制性内切酶酶切常见问题分析 问题一：DNA完全没有被内切酶切割
原 因
1. 2.
1. 2. 3.
标准底物检测酶活性 将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA 检查反应系统是否最佳
原 因
1. 2. 3.
1.
保存温度不合适 以稀释形式保存 贮藏缓冲液不适当
内切酶贮藏在含50%甘油的 贮藏液中，应在-20℃低温保 存 稀释酶液不宜长期存放，应一 次使用 使用厂家推荐的贮藏缓冲液 内切酶与500ug/ml的BSA一起 保存
2.
4.
低蛋白浓度
对 策
3. 4.
DNA电泳常见问题分析
问题六：电泳后DNA片段的带型弥散，不均一
原 因
1.
2. 3.
1.
内切酶星状活性
其它内切酶污染 底物中含其它DNA杂质
对 策
检查反应条件：甘油浓度大于12% ，盐度过低，Mn2+的存在及酶： DNA值过大均均可导致星状活性 ，降低酶的用量 用λDNA作底物检查酶切结果 电泳检查DNA，换用其它酶切， 纯化DNA片段
2. 3.
限制性内切酶酶切常见问题分析
原 因
1.
2.
DNA上结合有蛋白质
内切酶中含有DNA外 切酶

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1. 限制性内切酶的类型



根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活 性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。 第一类（I型）限制性内切酶能识别专一核苷酸顺序，在识别 位点很远的地方任意切割DNA链，切割核苷酸顺序没有专一 性，随机。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中 用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如 EcoB、EcoK等。 第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别 顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核 苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产 生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此也不能应 用于基因克隆。
结构的三大要素： • • 多克隆位点
选择标记（耐药性，LacZ）
• 独立的复制单位
由 pUC18改造而来，大小为 3162bp 。相当于在 pUC18中增加了带有 M13 噬菌体 DNA 合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。
（二）材料
模板DNA 引物：APO A1-GST2(载体：pGEX-6P-1) PrimerGST6p1-APOA1-Up: 5’ GGAATTCATGGATGAACCCCCCCAGAGCC -3’ EcoRI PrimerGST6p1-APOA1-down: 5’ CGCGTCGACTCA CTG GGT GTT GAG CTT CT-3’ SalI
3.
4. 5.
同上
同上 反应前离心数秒
6.
7.
将内切酶稀释，增大取样体积
电泳前将样品臵65℃保温5-10分 钟，取出后臵冰浴骤冷 使用标准反应缓冲液及温度，避 免强烈振荡 适当稀释酶液，反应液稀释的酶 不能贮藏
对 策
8.
9.
10. 11.
使用最佳反应体系
加大酶量5-10倍
限制性内切酶酶切常见问题分析 问题三：DNA片段数目多于理论值
内切酶失活 DNA不纯，含有SDS，酚 ，EDTA等内切酶抑制因子
4.
换用对DNA甲基化不敏感的同裂 酶酶解，重新将质粒DNA转化至 dcm-，dam-基因型的细菌菌株
换用不同切割非甲基化位点的同裂 酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I)，重新将质粒转至dcm+ dam+菌 株中扩增 将DNA底物与λDAN混匀进行切 割验证 换用其它的酶切割DNA或过量酶 消化进行验证
5’…… GAT ATC …… 3’
3’…… CTA TAG …… 5’ 这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。
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2. 限制性核酸内切酶的命名法
用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄 主菌的物种名称，如E. coli 用Eco表示，所以用斜 体字。 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌 (Heamophilus influenzae)Rd菌株用d，即Hind。 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制 与 修 饰 酶 ， 则 以 罗 马 数 字 表 示 ， 如 HindⅠ, HindⅡ，HindⅢ等。
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实验十 限制性酶切与连接
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载体（Vectors）
一种能够结合外源DNA 片段形成重组DNA，并能进行自我 复制的DNA 分子称为Vectors. 主要载体：质粒、噬菌体以及能在两个不同物种中存在的穿梭质粒。 随着生物技术的发展和科学研究的深入，不断出现具有不同功 能的新载体，如可以容纳几百万碱基的酵母人工染色体。
Yes
No
Ⅲ类
二 亚 基 双 5-7 bp 非 在 识 别 位 功能酶 对称 点下游 2426bp
Yes
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Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同 的切口－－５’端突出、３’端突出和平 末端。 限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人 们能在体外有目的地对遗传物质ＤＮＡ进 行改造，从而极大地推动了分子生物学的 兴旺和发展。

粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这 种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘 性末端。 如EcoRI的识别顺序为： 5’…… G|AATTC ……3’
3’…… CTTAA|G …… 5’
在双链上交错切割的位臵切割后生成 5’……G 3’……CTTAA AATTC……3’ G……5’
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1. 限制性内切酶的类型





第二类（Ⅱ型）限制性内切酶就是通常指的ＤＮＡ限制性内 切酶. 它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进行 切割，产生特异的ＤＮＡ片段； Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识 别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序； Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端 突出、３’端突出和平末端。 限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们能在体外有目 的地对遗传物质ＤＮＡ进行改造，从而极大地推动了分子生 物学的兴旺和发展。
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粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这 种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘 性末端。 如EcoRI的识别顺序为： 5’…… G|AATTC ……3’
3’…… CTTAA|G …… 5’
在双链上交错切割的位臵切割后生成 5’……G 3’……CTTAA AATTC……3’ G……5’
3.
4.
条件不适（试剂、温度）
DNA酶切位点上的碱基被 甲基化 DNA酶切位点上没有甲基 化（如Dpn I） DNA位点上存在其它修饰 DNA不存在该酶识别顺序
5.
5.Leabharlann 对 策6.6. 7.
7.
限制性内切酶酶切常见问题分析 问题二：DNA切割不完全
原 因
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.