08年第一期螺旋课堂--“荧光定量PCR技术” www.helixnet.cn/) 是一个以分子生物学实验及对实验结果进行处理为核心，以生物技术前沿发展为导向的一个专业型科学技术讨论社区。 本着“共分享，同成长”的理念，给广大生物科研工作者一个交流经验、分享资料的平台。 螺旋网版块设置主要分为三个部分： ¾实验技术交流（实验互助） ¾实验结果处理（生物信息学） ¾实验之余的生活 螺旋网的特色： 1、毕赤酵母表达系统； 2、发酵工艺 3、螺旋课堂； 4、Seminar； 5、生物学科研究进展； 6、实验交流及生物信息学。
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2008年螺旋课堂的课程计划！ 2007年已悄然逝去，2008年已向我们扑面而来。08年是共和国发展的关键一年，也是螺旋网抓住机遇，加快发展的关键一年。今年螺旋网将为各位螺友提供大量的关于生命科学的讨论主题，让各位螺友对生命科学的灵感相互碰撞，达到共鸣。还有螺旋网将联合一批一线生命科学人员为您的研究保驾护航。同时还将为大家提供各种资源包括各类电子书、生命科学研究进展、生物软件等。 为此，螺旋课堂08年的课程将围绕着最新的研究方法、研究进展进行课程设置。具体安排如下： 第一期：荧光定量PCR技术 第二期：原位杂交技术 第三期：引物的设计原理及方法 第四期：BAC库的构建技术 第五期：手把手教你进行序列分析
..................... 除以上技术外，欢迎大家点播！
以上讲座的具体时间详见论坛通知! 螺旋网：http://www.helixnet.cn 祝大家新年快乐，万事如意!
螺旋课堂第一课－－荧光定量PCR技术 Janson PCR技术的发明极大地推动了分子生物学的发展，而且迅速被推广和应用到生命科学的各个领域，可以说它是目前核酸分子水平的基础及应用研究中使用最广泛的一项技术。 常规PCR中，在扩增反应结束之后，我们一般通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，无法对PCR扩增反应进行实时检测，也无法对起始模板准确定量，而很多情况下，我们所感兴趣的是起始模板量，如转基因动植物中插入某种外源基因的拷贝数或者病人中某种病毒DNA/RNA的精确copy数等，如此，荧光定量PCR技术便应运而生。 本文将分为三大部分向大家介绍，首先是理论篇：首先了解荧光定量PCR的理论知识，如荧光定量PCR技术的原理、方法等；随后为实践篇：如实验的操作流程、注意事项、方法选择、结果分析与处理等；第三部分为问题分析与解答篇：荧光定量PCR过程中有哪些常见问题，我们如何避免和解决。 08年第一期螺旋课堂--“荧光定量PCR技术” 第一章 理论篇 一、荧光定量PCR技术发展史
用了PCR反应中的品进行准确定量的目，一些非特异的PCR而导致定量不准确等术。 1995年美国PE公司成功研制了TaqMan技术，1996年又推出了首台荧光定量PCR检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，并使用Ct值进行分析，荧光定量PCR才很快得到大家的接受，并广为应用。 近年来，荧光定量PCR技术不断完善，取得了突飞猛进的发展。由于其具有操作简单、快速方便、灵敏度高、重复性好、污染率低等优点，而被广泛应用于基础科学研究、药物研发、临床诊断、转基因研究、基因检测等各个领域研究当中。
二、荧光定量PCR概述 1、荧光定量PCR概念 所谓定量PCR技术（real-time PCR），是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法（图1）。 图1 荧光定量PCR反应原理
荧光基团
荧光检测元件Ct值
螺旋网：http://www.helixnet.cn 祝大家新年快乐，万事如意! 08年第一期螺旋课堂--“荧光定量PCR技术” 2、荧光定量PCR与普通PCR的主要区别
图2 终点法定量PCR的缺陷
理论上PCR是一个指数增长的过程，但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线。这是因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的Taq酶都被饱和以后，PCR就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是96次PCR重复实验，各种条件基本一致，所得结果有很大差异（图2）。 常规PCR的定量方法，测定的都是PCR的终产物，而不是起始DNA拷贝数。由于PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系（图2），所以不能根据最终PCR产物的量直接计算出起始DNA拷贝数。虽然加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。 而从图2也可以看出，虽然相同模版在同一台PCR仪上进行96次扩增，终点处检测产物量不恒定，但96次PCR扩增曲线都有一个共同的拐点，即荧光定量PCR中Ct值的重现性，恒定的Ct值为荧光定量PCR的分析提供了理
螺旋网：http://www.helixnet.cn 祝大家新年快乐，万事如意! 08年第一期螺旋课堂--“荧光定量PCR技术” 论依据。 前面我们对荧光定量PCR的历史、荧光定量PCR概念和与常规PCR区别有了大致的了解，但你可能心中存在许多疑惑：什么是扩增曲线？什么是Ct值？它们有什么特点？我们如何来判定荧光定量PCR反应中的Ct值，原理是什么？。。。。。。 为了使大家更好的理解、掌握荧光定量PCR技术，在介绍荧光定量PCR检测方法、动力学原理和数据分析方法前，有必要先介绍几个最基本的概念。 3、荧光定量PCR的几个基本概念 3．1扩增曲线 增曲线来进行说明。际上并不是一条标准示PCR循环数，Y－例关系。 图3荧光定量PCR扩增曲线示意图
荧光阈值 从图3可以很直观的看出，荧光定量PCR扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段（基线期），荧光信号指数扩增阶段（对数期）和平台期。在基线期，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。 3．2荧光阈值
螺旋网：http://www.helixnet.cn 祝大家新年快乐，万事如意! 08年第一期螺旋课堂--“荧光定量PCR技术” 在介绍荧光阈值之前，先了解一下荧光本底信号（图3），我们一般把荧光PCR的前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline，基线期），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍（机器自动设置）。我们在做荧光定量PCR实验时，经常采用手动设置，手动设置的原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，真正的信号是荧光信号超过域值（图4）。 图4 手工调整荧光阈值示意图
3．3 Ct值 了解了荧光阈值的概念后，Ct值就很好理解了。C代表Cycle，t代表threshold，所谓Ct值就是在荧光PCR扩增过程中，当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。如图3所示，黑色的线显示的是荧光阈值，当信号超过黑色线时所经历的循环数即为Ct值。从这也可以了解到Ct值是可以变化的，我们实验时带有一定的人为因素。而荧光定量PCR后面的数据处理要用到Ct值来计算，所以有关荧光阈值的设置就显得尤为重要。一般说来，新手按荧光PCR仪的自动设置为好，而如果你非常有经验，一般会手动设置荧光阈值。因为Ct值即达到荧光阈值所经过的循环数，所以它就与模版的拷贝数存在着线性关系，起始拷贝数越多，经过的循环数就越少，Ct值也就越小，反之亦然。正常的CT值范围在18-30之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。 前面也提到过，同一模板经过96次PCR扩增，扩增产物虽然不恒定，但Ct值极具重现性。根据这个特点，我们可以利用已知起始拷贝数的标准样品的Ct值做出标准曲线，只要在同一次PCR实验中得到未知样品的Ct值，就可以根据曲线算出该未知样品的起始拷贝数。 接下来我们就来看看通过Ct值算出拷贝数的数学原理是怎样的： 首先我们来回顾一下PCR扩增原理（图5），从PCR原理图中我们也可以很清
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