乙型肝炎病毒核酸定量测定 （PCR-荧光探针法）
2016.4.27
实时荧光定量PCR：
利用荧光信号的变化实时检测PCR反应中每一个循环扩增产 物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分 析。
Ct值：PCR扩增反应中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值
时所经过的扩增循环次数。模板DNA量越多，荧光达到阈值的循 环数越少，则Ct值越小。
琼脂糖凝胶电泳：
2.实验步骤：
2.1 安装电泳槽 2.2 制备琼脂糖凝胶，称取2g琼脂糖，溶于100mL 1×TAE中，微波加热至完 全溶解。
2.3 灌胶：将的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上。
2.4 待琼脂糖胶凝固后，在电泳槽内加入电泳缓冲液，然后拔出梳子。 2.5 加样。 2.6 120V稳压约20min. 2.7 观察。
常用荧光标记方法：
2. Taqman 探针法 探针两端分别标记一个报告荧光基团(R)和一个淬灭荧光基团(Q)。 PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧 光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号 ，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信 号的累积与PCR产物形成完全同步。
序号
1 2
试剂名称
乙型肝炎病毒-核酸释放剂 乙型肝炎病毒-PCR反应液
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
主要成分及作用
释放样本中的核酸 引物、探针、dNTPs、Mg2+、PCR buffer
3
4 5 6
乙型肝炎病毒-酶混合液
乙型肝炎病毒-内标 乙型肝炎病毒-定量参考品A 乙型肝炎病毒-定量参考品B
Taq酶、UNG酶
阳性内对照，避免PCR假阳性 定值的阳性样本，浓度：4×107IU/mL 定值的阳性样本，浓度：4×106IU/mL
2.样品处理：
2.1 每组取3个定量PCR管，每个PCR反应管中加入HBV-核酸释放剂5ul， 然后加入待测样品15ul ，阴性对照、阳性对照以及定量参考品A,B,C,D 各15ul，吸打3-5次混匀（轻轻吸打，避免出现气泡）； 2.2 间隔10分钟以上，每管加入PCR混合液40ul，2000rpm离心30秒。
7
8 9 10
乙型肝炎病毒-定量参考品C
乙型肝炎病毒-定量参考品D 乙型肝炎病毒-阴性对照 乙型肝炎病毒-阳性对照
定值的阳性样本，浓度：4×105IU/mL
定值的阳性样本，浓度：4×104IU/mL 阴性样本（已灭活） 定值的阳性样本（已灭活）
操作步骤：
1.试剂准备： 1.1 待测样品：取一个1.5mL的EP管，一个PCR管里需要的量：反应液 38ul+酶混合液2ul+内标0.2ul，每个样本需要做3个重复，所以吸取反应 液114ul+酶混合液6ul+内标0.6ul ，在EP管中充分混匀，即为PCR混合液 ，瞬时离心后备用。 1.2 阳性对照、阴性对照、定量参考品A,B,C,D：吸取反应液684ul+酶混 合液36ul+内标3.6ul ，在EP管中充分混匀，即为PCR混合液，瞬时离心 后备用。
琼脂糖凝胶电泳：
1.实验原理：
琼脂糖是一种固相电泳支持物，DNA在碱性条件下带负电荷，在电场中通过凝胶介 质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率液不同 ，因此可以分离鉴定和提纯DNA片段。
胶浓度与DNA片段大小的关系：
凝胶浓度（%） 线性DNA长度（bp） 0.5 0.7 1.0 1.2 1.5 2.0 1000-30000 800-12000 500-10000 400-7000 200-3000 50-2000
3. PCR扩增 4. 琼脂糖凝胶电泳检测
5. 结果分析
6. 质量监控 5.1 HBV阴性对照：无Ct值显示；但HBV-内标检测为阳性（Ct值≤40）。 5.1 HBV阳性对照：检测浓度值介于1.26×105-1.26×106IU/mL. 5.4 四个定量参考品（A,B,C,D）：均检测为阳性，且标准曲线相关系数 r≥0.98.
标准曲线：利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，横坐
标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值，因此只要知道未知样 品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
常用荧光标记方法：
1. SYBR Green Ⅰ SYBR Green Ⅰ是一种结合于所有双链DNA螺旋小沟区域的 具有绿色激发波长的染料。