PCR 反应曲线
R n+
Sample
Threshold
Rn
Ct
R nBaseline
No Template
定量准确的要素
未知样品 标准品：产生标准曲线 内参比（Internal Standard）－ROX 校正样品管和加样误差 内对照（Internal Control）： 校正扩增效率的误差
+/-对照：检验试剂和仪器的可靠性 6次重复：满足统计学要求
18S ribosomal RNA endogenous control amplifications (VIC™) showing all 20 sample wells
Detection of mRNA splice variants
主要内容
1. Taqman探针原理
2. CT值和阈值的确定
变异主要来源是样品RNA的纯度和完整性，应 设内源性参照物。
若使用DNA参照物，反转录酶的效率未受控 制。
RT-PCR定量的条件
确定PCR反应曲线上的有效范围，即 在平台效应出现以前PCR扩增得到的终 产物与加入的RNA数量呈线性关系。
确定足够的样品数，保证可对PCR扩 增产物量间差异进行统计分析。
检测范围更宽，速度更快。
Application
Quantification Mutation/Allele detection
Multiplex RT-PCR
Detection of mRNA splice variants
Mutation/Allele detection
Use different reporter dyes One increase homozygosity Two increase heterozygosity
Taqman荧光定量PCR技术
•特异性荧光 标记探针
•Taq酶 5’→3’ 外切酶活性
设置内参照
分为两种：在扩增反应中加入的外 源参照物和样品中正常存在的内源参照 物。
内源性参照物通常使用“管家” 序 列或rRNA。
实时RT-PCR特点
扩增反应处于对数增长期，无平台效应。 无需处理PCR反应产物，减少污染。
多色荧光技术
准确的荧光定量要求ROX校正和IPC校正 检材和对照最好在同一反应管中，误差最小 多重检测要求仪器有多种荧光检测能力 只有ABI的仪器才具有四色检测能力：
FAM：标记目的基因探针 VIC：标记第二个目的基因或IPC探针 TAMRA：淬灭基团 ROX：
内参比荧光
使用ROX内参比的效果
光纤出口处的激光强度；管盖厚度、透光性 缓冲液和反应体积等
校正管间差异，保证实验结果的重现性
5’ Nuclease Multiplex Assay
FAM™ dye labeled 35S Target
VIC™ dye labeled ER
阳性内对照(IPC)
为操作方便，取样一般以克或uL为单位
达到阈值时的计算公式
RB, Rs 和 Ex 是确定的 Rn=RT=阈值 n=CT= 达到阈值时的循环数
RT RB X O (1 E X ) CT RS
CT值与起始DNA拷贝数的关系
Ct
起始DNA拷贝数
阈值的作用：确定CT值
Rn (荧光信号)
Threshold（阈值）
CT Cycle Number（循环数）
IPC一般选用基因组中单拷贝的管家基因，其 定量结果代表了基因组的数量，也就是检材 中细胞的数量。 CT = CT Sample - CT IPC将定量结果校正为以基
因组为单位，不同样品之间具可比性。
阳性内对照(IPC)
IPC除了用于计算CT，校正定量结果外，还可以起 到阳性对照的作用，用于判断阴性结果的真伪。
内对照用于确认阴性结果
目的基因 CtFAM = 40
IPC (VIC layer) 基因 CtVIC = 27
假阴性结果
目的基因 CtFAM = 40
IPC (VIC layer) 基因 CtVIC = 40
阳性结果
目的基因 CtFAM = 29
IPC (VIC layer) 基因 CtVIC = 28
确定阈值的标准：基线
阈值 = 基线（背景）信号均值 ＋基线（背景）信号标准偏差 x 10
标 准 偏 差 3个循环
基线
阈 值
基线的范围： 从第3个循环起到指数增长开始 前3个循环止。 一般取3-15循环。
阈值选择的推导原理
1. 基线（空白）信号的产生是由于测量的偶然误差引 起的 2. 偶然误差的结果满足对数分布 3. 阈值 = 基线（背景）信号均值＋基线（背景）信 号标准偏差 x 10 4. 由于测量的偶然误差而导致测得的荧光信号大于阈 值的概率小于10－5 5. 当荧光信号大于阈值时，可以肯定是由于PCR的扩 增使得荧光信号强度可以测量得到精品课件！精品课件！重复样品
定量的结果需要进行统计学处理：平均值和 标准偏差。因此需要重复实验 每个样品重复6次以上
消除定量误差
Multiplex RT-PCR
Advantage: Time and reagent saving Limitation: availability of multiple reporters excitation and detection ability
多重定量PCR结果
TNF-, TGF-, TNF- and lymphotoxin- amplifications (FAM™) in replicates of 5
3. ROX内参比荧光的作用
4. IPC内对照的作用
退火，开始延伸
5’ 3’ 5’
Forward Primer
TaqMan® R Probe Q
5’
3’ 5’
Reverse Primer
替换
5’ 3’ 5’
Forward Primer
R
Q
5’
3’ 5’
Reverse Primer
剪切
R
Q
5’ 3’ 5’
真阴性
假阴性
检材-； IPC+ 检材-； IPC-
常用的内对照：
18S
rRNA -actin GAPDH
标准品的选择
标准品可以从ABI购买，也可以自己制备 标准品的单位并不重要，取决于对最终结果的 要求：拷贝数，%，ng/uL, mol/uL 如转基因定量的国际标准是%(w/w) ，标准品 最好是先将不同重量比的转基因与非转基因 食品粉末混合，然后抽提DNA；不要先抽好 DNA，再用水梯度稀释 如果要得出的是样品中的基因拷贝数，则梯度 稀释已知摩尔浓度的DNA
传统RT-PCR与实时RT-PCR的流程比较
荧光定量RT-PCR基本流程
荧光测定的光学原理图
光源 滤光镜 反射镜 CCD 相机 多元镜
夫累舍尔透镜 96孔透镜组
双色镜
滤镜轮 96孔板
Molecular Beacon Method
Dye Incorporation Method
Hybridisation Probe Method
使用 ROX
不使用 ROX
Beta actin TaqMan定量
使用ROX内参比的好处
提高荧光定量的定量精度，减少孔间差异
报告荧光
不使用参比荧光 校正的结果
参比荧光
样品管1 使用参比荧光 校正的结果
样品管2
ROX荧光内参比的作用
以固定浓度存在于TaqMan PCR缓冲液中，常用ROX 荧光强度均一化(Normalize)： Rn = RReporter / RROX， Rn = Rn,sample – Rn,blank 影响荧光信号强度的因素包括：
5’
3’ 5’
延伸结束
R
Q
5’ 3’ 5’ 5’
3’
5’
荧光定量PCR实验荧光强度的计算公式
Rn RB X O (1 EX ) RS
n
Rn=总荧光强度 RB=基本（空白）荧光强度 XO=靶基因起始拷贝数 EX=扩增效率（0< EX < 1） n =扩增循环数 RS=每个荧光分子的荧光强度
竞争性RT-PCR
PCR的终产物量取决于靶序列与竞争性 序列量的起始比例。 理想情况下，靶序列与参照物以相同 的效率扩增，在琼脂糖凝胶电泳中区别开 。
竞争性RT-PCR
参照物片段分两类: - 同源性片段——与靶序列只有微小差 别
- 非同源性片段——除两端引物－模板 区以外与靶序列不同
竞争性RT-PCR面临的问题
非竞争性RT-PCR
目前主要采用荧光实时RT-PCR， 放射性标记核苷酸的方法已基本淘汰。
实时RT-PCR
实时RT-PCR就是在PCR扩增的每一个循 环后分别检测其PCR产量，借助计算机数据 处理，可以描绘出PCR扩增循环过程中PCR产 物变化曲线。
根据PCR 变化曲线计算出目标靶基因 分子数。