2、反应参数的确定：
一般为：94 ℃，10-20S 60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高） 也可通过温度梯度优化退火温度 72 ℃，45 S，
3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，信号/背景比值的最大值 引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM
4、其他与常规PCR相同

实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值
Ct值的定义：
PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈 值时所经过的扩增循环次数
C(t) value
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实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值的重现性
起始模板的定量 基因型分析 产物鉴定 SNP（单核苷酸多态性）分析
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Molecular beacon (分子信标)
优缺点
优点
高特异性：对目标序 列
检测SNP最灵敏的试 剂之一 荧光背景低
缺点
只能用于一个特定 目标 设计困难 价格比较高
实时荧光定量PCR 方法 1 ---------SYBR Green 法
SYBR Green
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SYBR Green 法
工作机理
SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位
SYBR Green
SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光 复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在 此阶段采集荧光信号。

实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 熔解曲线分析
荧光强度
Tm
温度
Tm值：DNA解链一半时的温度
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实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 熔解曲线分析
-dI dT
Tm
• 将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT)
实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每
一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线 的分析对起始模板进行定量分析
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实时荧光定量PCR原理定量原理
如何对起始模板定量？
通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析
Log of DNA concen----------PCR反应的建立
反应体系的建立及优化: 1. SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不
易检测 2. Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 3. MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物 4. 反应Buffer 体系的优化 5. 反应温度和时间参数:由酶和引物决定 6. 其他与常规PCR相同

实时荧光定量PCR 原理 -------荧光阈值
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荧光信号阈值 （threshold ）：
前15个循环信号作为荧光本底信号 （baseline），即样本的荧光背景值和阴 性对照的荧光值 荧光域值的缺省设置是3～15个循环的 荧光信号的标准偏差的10倍 手动 设置：原则要大于样本的荧光背 景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽 量选择进入指数期的最初阶段，并且保证 回归系数大于0.99 真正的信号:荧光信号超过域值

实时荧光定量PCR定义
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光 信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标 准曲线对未知模板进行定量分析的方法
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实时荧光定量PCR 原理
实时原理
常 规 PCR技术：
对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析 无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测

SYBR Green 法
优点
对DNA模板没有选择性 ----适用于任何DNA
使用方便 -----不必设计复杂探针
非常灵敏 便宜
优缺点
缺点
容易与非特异性双链DNA结 合，产生假阳性
但可以通过融解曲线的分析， 优化反应条件 对引物特异性要求较高
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SYBR Green 法
非特异性产物
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融解曲线分析
融解曲线分析，单一峰 无非特异性荧光 定量准确
融解曲线分析，出现杂峰 其他产物出现非特异性荧
光，因此定量不准确

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TaqMan法
优缺点
优点
对目标序列的高特异性 ------阴性结果确定
设计相对简单 ------与目标序列某一区域
互补 重复性比较好
缺点
只适合一个特定的目标 委托公司标记，价格较
高
不易找到本底低的探针
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实时荧光定量PCR技术的原理及应用 (Real time Quantitative PCR)
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讲 座提纲
实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量技术的应用
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介绍三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct值
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实时荧光定量PCR 原理 ----------- 扩增曲线
荧光基团
荧光检测元件 扩增曲线图：
横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度
每个循环进行一次荧光信号的收集
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实时荧光定量PCR原理 绝对定量
确定未知样品的 C(t)值 通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量
Sample
25
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讲 座提纲
实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR实验设计及应用
纵 轴 ： 荧 光 信 号 量
横轴：PCR反映循环数
Ct值的特点：
▪相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；
▪ Ct值则极具重现性
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实时荧光定量PCR 原理 --------- 定量原理
•理想的PCR反应：
•
X=X0*2n
•非理想的PCR反应：
SYBR Green 法
模板DNA量越多，荧光达到 域值的循环数越少
Log浓度与循环数呈线性关系， 根据样品Ct值，就可以计算出样 品中所含的模板量
Flourescenc
定量原理
Ck 102
Sample
Ck 104
Cycle number
Cycle number
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荧光共振能量转移（FRET） 探针与DNA杂交时产生荧光
-----变性过程：产生非特异性荧光 -----延伸过程：不产生荧光 ------退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号
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Molecular beacon (分子信标) 应用范围

实时荧光定量PCR 方法 3------- Molecular beacon 法(分子信标)
环
➢标记荧光的发夹探针
茎
荧光素 淬灭剂
➢环与目标序列互补 ➢茎由互补配对序列组成
发夹型杂交探针
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Molecular beacon (分子信标) 工作原理
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SYBR Green 法
应用范围
起始模板的测定
基因型的分析
融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规 PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一 引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。
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实时荧光定量PCR 方法2 -------TaqMan法
TaqMan---水解型杂交探针
与目标序列互补
❖ 5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 ❖ 3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) ❖ 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 ❖ Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针
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实时荧光定量PCR 原理 --------- DNA 产物的荧光标记
非特异性荧光标记：
1、 SYBR Green
特异性荧光标记：
2、TaqMan
3、Molecular Beacon
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Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品 可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模 板量
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QUALITY CONTROL -EFFICIENCY CURVES
• use pcr baseline subtraction (not curve fitting default option) • set the threshold manually to lab standard • check all melting curves are OK • check slopes are parallel in log view • delete samples if multiple dilutions cross line together (usually