第二章 光电比色计第一节 比色分析比色分析是基于溶液对光的选择性吸收而建立起来的一种分析方法，又称吸光光度法。

有色物质溶液的颜色与其浓度有关。

溶液的浓度越大，颜色越深。

利用光学比较溶液颜色的深度，可以测定溶液的浓度。

根据吸收光的波长范围不同以及所使用的仪器精密程度，可分为光电比色法和分光光度法等。

比色分析具有简单、快速、灵敏度高等特点，广泛应用于微量组分的测定。

通常测定含量在6-1～6-4mg/l 的痕量组分。

比色分析如同其他仪器分析一样，也具有相对误差较大（一般为1%～5%）的缺点。

但对于微量组分测定来说，由于绝对误差很小，测定结果也是令人满意的。

在现代仪器分析中，有60%左右采用或部分采用了这种分析方法。

在医学学科中，比色分析也被广泛应用于药物分析、卫生分析、生化分析等方面。

一、朗伯-比尔（Lambert-Beer ）定律溶液颜色的深浅与浓度之间的数量关系可以用朗伯-比耳定律来描述。

当一束平行单色光（只有一种波长的光）照射有色溶液时，光的一部分被吸收，一部分透过溶液（图2-1-1）。

设入射光的强度为I 0，溶液的浓度为c ，液层的厚度为b ，透射光强度为I ，则II 0lg =Kcb 式中II 0lg 表示光线透过溶液时被吸收的程度，一般称为吸光度（A ）或消光度（E ）。

因此，上式又可写为：A=Kcb上式为朗伯-比尔定律的数学表示式。

它表示一束单色光通过溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。

式中，K 为吸光系数，当溶液浓度c 和液层厚度b 的数值均为1时，A=K ，即吸光系数在数值上等于c 和b 均为1时溶液的吸光度。

对于同一物质和一定波长的入射光而言，它是一个常数。

比色法中常把0I I 称为透光度，用T 表示，透光度和吸光度的关系如下： A ＝II 0lg ＝T 1lg ＝－lg T 当c 以mol·L -1为单位时，吸光系数称为摩尔吸光系数，用ε表示，其单位是L·mol -1·cm -1。

当c 以质量体积浓度（g·ml -1）表示时，吸光系数称为百分吸光系数，用E(%)表示，单位是ml·g -1·cm -1。

吸光系数越大，表示溶液对入射光越容易吸收，当c 有微小变化时就可使A有图2-1-1光吸收示意图较大的改变，故测定的灵敏度较高。

一般ε值在103以上即可进行比色分析。

如果测定某种物质对不同波长单色光的吸收程度，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图可得一条曲线，即物质对光的吸收曲线，可准确地描述物质对光的吸收情况。

二、比色分析的测量方法无论是光电比色计还是分光光度计，最常用的测量方法有如下两种。

1.标准曲线法先配制一系列不同浓度的标准溶液，用选定的显色剂显色。

选用合适波长的入射光（光电比色计用滤光片，分光光度计可转动波长调节器）。

测定时先以空白溶液调节透光率100%，然后分别测定标准系列的吸光度。

以吸光度为纵坐标，准曲线（或称工作曲线）。

例如，测定维生素B12时，可预先绘制维生素B12的A-c标准曲线（图2-1-2），再用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度，即可从标准曲线上找出被测溶液的浓度或含量。

这种方法叫做标准曲线法。

标准曲线可在固定仪器和方法的条件下多次使用，适合于经常性工作。

但若仪器不同或测定方法及条件改变，测得的标准曲线不同。

因此在更换任何测定条件时都需重新绘制标准曲线。

图2-1-2 维生素B12的标准曲线2.直接比较计算法若仅对个别样品进行测定，且A-c曲线线性良好，可不作标准曲线而直接比较测定结果。

先配制一个被测物质溶液浓度相近的标准溶液，与被测溶液在相同条件下测定吸光度。

根据下式可以计算。

A标=K标c标b标A测=K测c测b测由于使用同一波长的入射光，采用同样的比色皿，测定同样的物质。

所以K标=K测b标=b测因此A标/A测=c标/c测则c测=（A测/A标）× c标现代光电比色计，大都加有对数运算电路。

使用时只要选用一种标准溶液进行标定，然后便可以用仪器的显示装置直接读取溶液的浓度值，使工作效率大大提高。

第二节光电比色计的基本结构利用光电池或光电管等光电转换元件作检测器，来测量通过有色溶液后透射光的强度，从而求出被测物质含量的方法叫做光电比色法。

基于此而设计的仪器叫做光电比色计。

一般的光电比色计由光源、滤光片、比色皿、光电检测器、放大和显示等六部分组成。

原理方框图如图2-2-1所示。

图2-2-1光电比色计的结构图光源发出的复合光经滤光片滤波后，变为近似的单色光。

此单色光通过比色皿时，被里面的样品吸收掉一部分，然后照射在光电检测器上。

光电检测器将光信号的强弱转变为电信号的大小，最后经放大，由显示部分显示出测量结果。

下面，我们对每一部分做一个详细说明。

一、光源比色分析所用的理想光源应在整个所需要的波长范围内具有均匀的发光强度。

也就是说，它的光谱应该包括所用的波长范围内所有波长的光，光的强度应该足够大，并且在整个光谱区中，其强度不应随波长有明显的变化。

实际上，这种理想的光源并不存在。

所有光源的光强都随波长而变。

在可见光范围内常用的光源有钨丝灯和钨卤素灯。

在紫外波段常用的光源灯为氘灯（氢灯）。

汞灯通常作为波长标准器用。

在光电比色计和可见光分光光度计中，采用6～12V的钨灯，其最适宜的波长范围是360～1000nm，为使光的强度稳定，须用稳压装置来稳定电压。

钨丝灯泡发出的光趋近于自然光，即为各种波长（320～1100nm）的散射混合光，通过聚光镜使从光源射来的光成为平行光。

聚光镜通常使用凹面镜或凸透镜。

（一）钨丝灯钨丝灯是可见光区和近红外区最常见的光源。

它适应的波长范围在320～2500nm之间。

钨丝灯靠电能将钨丝加热至白炽发光。

钨丝灯的结构简单，价格便宜，使用寿命也长，通常可以工作1000小时以上。

其不足之处是在点燃时，钨丝会不断向外蒸发出钨原子。

灯丝的温度越高，蒸发的速度越快。

钨丝的蒸发不但会使灯丝变细、寿命变短，更重要的是，蒸发出的钨原子到达灯泡内壁的时候，会沉积在内壁上。

随着时间的延长，内壁的钨会越来越多，使灯泡透出来的光越来越弱。

严重的会使灯壁发黑，无法使用。

使用卤钨灯可以解决这一问题。

（二）卤钨灯卤素加入到钨丝灯里面，大大改善了钨丝灯的使用寿命。

到目前为止，在理论和实践上应用卤钨循环原理比较成功的是碘钨灯和溴钨灯。

最早问世的卤钨灯是用碘作循环剂的碘钨灯。

这是因为在4个卤族元素里，碘的性质最不活泼，不像其他几种卤素那样有强烈的腐蚀作用。

待灯泡里充进纯碘、玻壳壁的温度控制在250～1200℃之间，从灯丝上蒸发出来的钨就会在玻壳壁附近与碘化合成碘化钨。

随着气体的对流，碘化钨将扩散到灯丝附近，由于这里的温度可以高到2000℃以上，不太稳定的碘化钨就会在这里分解成碘和钨，钨重新回到灯丝上继续工作，碘则再次向玻壳方向扩散去完成新的“搬运”钨的任务。

同普通白炽灯相比，碘钨灯大大减少了钨的蒸发量，延长了使用寿命，提高了工作温度和发光效率。

普通白炽灯的平均使用寿命是1000个小时，碘钨灯要比它长一半，发光效率提高30％。

从体积来看，碘钨灯显得特别小巧玲珑，同样一只500瓦的灯泡，碘钨灯的体积只有白炽灯的1％。

它的玻壳里除了有碘，还充进了惰性气体，又小又结实，充气压力高达1.5～10个大气压。

（三）光源灯的稳压电路为了获得稳定的测量结果，保持光源灯发光稳定性是非常重要的。

各种光电比色计和分光光度计都有稳压装置。

上述两种钨灯既可以用交流供电，也可以用直流供电。

在交流供电时，通常采用磁饱和稳压器供电；在直流供电时，通常采用电子稳压电路供电。

目前绝大部分采用直流供电。

图2-2-2所示为典型的串联型稳压电路。

很多的检验仪器的稳压电源都采用此电路输出稳定的电压。

其中图2-2-2为原理电路，图2-2-3为组成方框图。

它由取样电路、基准电压电路、比较放大电路及调整管四个基本部分组成。

因这种稳压电路的主回路是由调整管与负载串联而成，故称之为串联型稳压电路。

图2-2-2串联型稳压电路原理图图2-2-3串联型稳压电路方框图二、滤光片由朗伯-比尔定律我们知道，在比色分析时一定要使用单色光。

滤光片就是产生单色光一种装置。

滤光片的作用是只让一定波长范围的光透过，而将其余不需要的波长的光滤去。

它相当于电路中的带通滤波器。

滤光片又叫滤色片。

其作用是控制波长或能量的分布。

即它只让一定波长范围内的光通过，而将其余不需要的波长的光滤去。

它相当于电路中的带通滤波器。

滤光片通过的波长范围越窄、透射比越大，说明其质量越好。

三、比色皿比色皿又叫比色杯、比色池、比色槽、吸收池等。

它主要用来盛装比色分析时的样品液。

在可见光范围内，比色皿常用无色光学玻璃或塑料制成；在紫外区，常用石英玻璃来制作。

比色皿的形状一般为方形的，其他形状的比较少。

此外，还有流动比色皿、微量比色皿、可拆卸比色皿等。

如图2-2-4所示。

标准带盖比色皿标准带塞比色皿各种方形比色皿避光流动比色皿黑壁带盖微量比色皿圆筒形比色皿图2-2-4各种比色皿除了盛放液体的比色皿之外，还有用来盛装气体的比色皿。

气体比色皿必须加有盖子。

在检定双光束紫外分光光度计的分辨率时所用的比色皿就必须使用带盖的比色皿。

由于经常用来盛装各种化学溶液，比色皿除了具有良好的透光特性之外，还应有较强的耐腐蚀性。

尽管可以做成各种形状和尺寸，但国际上规定，液层厚度（即内径）为10mm的比色皿为标准比色皿。

(生化分析仪使用的比色皿光径为0.5 0.6 1.0三个尺寸)。

在使用中应该注意的是，每台仪器所配的比色皿都是成套的，所以一台仪器与另一台仪器之间所配的比色皿不能混着乱用。

否则，会带来较大的测量误差。

在同一测定中所使用的所有比色皿的光径（内径）必须一致。

检验比色皿是否符合要求的方法是：先在各比色皿中放入相同的有色溶液，然后将比色皿放入仪器中，在某些规定的波长下进行测量。

在其他条件不变的情况下，读出的透射比误差应小于0.5%。

否则，说明误差太大，不应使用。

比色皿的内壁和透光外壁都应注意清洁，不能用硬质纤维擦或用手去摸，以免擦伤或粘上手汗。

其不透光的两壁是供取、放用的，通常被磨成毛沙面或其他不透光面，以示区别。

使用比色皿时，其放置方向也应注意。

因为透光方向换向后，其透光本领可能会发生改变。

有的比色皿上标有箭头，用来指示光的方向。

使用时，溶液不要放得太满，以防液体溢出。

一般溶液只要稍多于1/2 即行。

若有液体溢出，一定要把其外表的水分擦干。

否则，会产生光的反射和折射，严重影响测量结果。

四、光电检测器在测量中须把光信号的变化转换成电信号的变化才能定量测量。

这种利用光电效应把光能转化为电能的器件，叫做光电检测器。

在光谱仪器中常用的光电检测器有光电池、光电管、光电倍增管以及半导体光电二极管、光敏电阻等。