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第10章 现代生物技术的应用
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二、在维生素生产中的应用
简化维生素的发酵工艺 如 Vit.C的传统生产工艺为“两步发酵法”。如今可将第二步发
酵菌株中与发酵生产Vit.C相关的基因转移至第一步菌株中,构建成新
的工程菌株,这样Vit.C的生产过程只需一步发酵即可完成
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第三节 基因工程在生物制品制造中的应用
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传统方法制备疫苗:
④疫苗:利用基因工程技术将抗原克隆到E.coli或酵母中,用工程菌生产
疫苗,产量高、工艺简单、操作安全
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第一节 基因工程在抗生素生产中的应用
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抗生素生物合成并非单一基因的直接产物,而是由初级 代谢产物经过一系列酶催化产生的次级代谢产物,其形成
过程是一个复杂的、多因素调节的过程
传统的提高微生物产生抗生素能力的方法主要是用诱 变剂(如紫外线、化学诱变剂等)处理微生物,获得生产 能力较高的突变株。80年代,人们开始将DNA重组技术应用 于次级代谢产物的生物合成上;通过生物合成酶基因的分 离、质粒的选择、基因重组与转移、宿主表达等方面
抗生素的杀灭作用;而且有些抗性基因的产物还直接参与抗生素的
合成。抗性基因经常与生物合成基因连锁,是激活生物合成基因进 行转录的必需成分。抗性基因必须先进行转录,建立抗性后,生物
合成基因的转录才能进行。抗生素的生产水平是由抗生素生物合成
酶与对自身抗性的酶所共同确定
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三、改善抗生素组分
许多抗生素产生菌可以同时产生多种抗生素,这些组分的化学结
先将抗性基因克隆到标准宿主或产生菌的敏感突变株中,再分析与
之紧密连锁的DNA,就可能找到生物合成基因;也可利用已因的DNA片段
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⑥寡核苷酸探针法
根据抗生素生物合成酶基因的氨基酸序列,推导出其基因序列,然
后人工合成寡核苷酸,并以此寡核苷酸作为探针,从基因中克隆出7②阻断变株法
通过一系列阻断变株的互补结果来确定被克隆DNA片段的性质。即首 先经诱变获得一系列生物合成阻断变株(不能合成抗生素),用互补共 合成法来确定这些变株在生物合成途径中的相互位置。从野生型菌株中
分离DNA,与载体连接后转入阻断因
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母、酶制剂生产菌的育种多采用细胞工程技术,均得到了非凡的成果,在食用酒精
和食品专用酶的生产中发挥了巨大的效能。
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细胞工程的应用:
1、细胞工程育种:在细胞水平上的原生质体制备与融合有利于实现远缘遗传物质的
直接交换,促进遗传资源的创新。
2、细胞培养:利用细胞工程技术生产生物来源的天然食品或天然食品添加剂
3、通过基因工程可以改变酶的性质,生产食品结构改良剂 4、基因工程技术还可用于食品工业中新型蛋白质、单细胞蛋白、维生素酶制剂、微
生物多糖、淀粉糖的生产
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蛋白质工程:
蛋白质工程是利用X-射线衍射和电子计算机图像显示计算,确定天然蛋白质的
三维构想和活性部位,分析设计需要改造的氨基酸残基,然后采用基因定位突变的
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2.克隆抗生素生物合成基因的策略和方法
①在标准宿主系统中克隆检测单基因产物 ②阻断变株法 ③突变克隆法 ④直接克隆法
⑤克隆抗生素抗性基因法
⑥寡核苷酸探针法 ⑦同源基因杂交法
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①在标准宿主系统中克隆检测单基因产物
鸟枪克隆法:这是一种由生物基因组提取目的基因的方法。首先利用物理方 法(如剪切力、超声波等)或酶化学方法(如限制性内切核酸酶)将生物细胞染 色体DNA切割成为基因水平的许多片段,继而将这些片段与适当的载体结合, 将重组选出含有某一基因的菌株,从中将重组的DNA分离、回收。 这种方法也就是应用基因工程技术分离目的基因,其特点是射 击”原理去“命中”某个基因。由于目的基因在整个基因组中太少太小,在 相当程度上还得靠“碰运气”,所以人们称这个方法为“鸟枪法”或“散弹 枪”实验法 利用鸟枪克隆法,把抗生素产生菌DNA克隆到最常用的宿主——变青链霉 菌中,通过检测宿主菌中个别基因产物,筛选克隆,从而分离到相应的基因
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第二节
基因工程在氨基酸和维生素生产中的应用
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一、在氨基酸生产中的应用
1.在酶法生产方面,主要通过克隆某些酶系基因来生产氨基酸 如 在L-Trp生产中,利用色氨酸合成酶基因和丝氨酸转羟甲基酶基 因的重组质粒,在E.coli中克隆化;可使L-Trp产量高达9g/L
2.在利用转氨酶反应生产氨基酸方面,将相应的转氨酶基因克隆到工程 菌中
将抗生素产生菌的DNA部分酶切的20~40bp的片段连接到质
粒的表达位点上,转化变青链霉菌,培养,筛选具有抗菌活性转化子
由于抗生素生物合成基因往往成族存在,使得有时可能需要克隆整 套生物合成基因。故此法主要用于基因族相对较小(≤30kb)的抗生素 生物合成基因
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⑤克隆抗生素抗性基因法
抗生素生物合成基因和抗性基因往往是连锁的,表达也是协同的 (否则菌体本身没有抗性,容易被自身所产生的抗生素杀灭),且抗性 基因一般只有1~2kb,容易检测于克隆
③突变克隆法
利用整合质粒或噬菌体,将原株DNA转入到抗生素产生菌中。由于 基因有同源性,有可能发生基因重组,一旦某DNA片段的插入干扰了原 株某个生物合成基因的转录,即得到这个生物合成基因的阻断变株,其
相应的DNA片段就是这个阶段的生物合成基因
此法由于要利用噬菌体,因而有一定局限性
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④直接克隆法
免疫动物
动物培养
抽血
分离纯化
冻干保存
有的疾病由于病原微生物具有高度的寄主专一性(如乙肝病毒),只
能感染人及与人亲缘关系近的动物(如黑猩猩),故不能用传统方法制备
基因工程疫苗制备: 寻找病原微生物的致病基因,通过高表达质粒转入相应的宿主,制备 成基因工程菌,然后培养工程菌,表达出相应疫苗
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二、现代生物技术在食品工业方 面的应用
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生物技术简介:
生物技术是对生命有机体进行加工改造和利用的技术, 它是2 1世纪高新技术的 核心之一。目前,生物技术已被应用于工农业、食品加工、医疗保健等众多领域中。 而食品生物技术是生物技术的重要分支学科,主要指生物技术在食品工业中的应用, 其作用主要体现在四个方面,一是利用基因工程、细胞工程技术对食品资源的改造 和改良;二是利用发酵工程、酶工程技术将农副原材料加工制成商品,如调味品、 酒类、酸奶等发酵制品;三是利用这些生物技术产品进行二次开发,形成新的产品, 如高果糖浆,食用添加剂等;四是利用酶工艺、发酵技术、生物反应器等对传统食
第十章
现代生物技术的应用
一、利用现代生物技术改造传统制药工业
现代生物技术不仅直接提供IFN、IL、EPO、CSF等基因工程药物,也广 泛用于改造抗生素和生物制品等传统医药工业。主要体现在以下几个方面
①抗生素:可从产生菌中分离出生物合成酶基因,进行克隆,提高生产菌
的生物量,或得到新的杂合抗生素 ②氨基酸:利用生物技术得到基因克隆的生产菌,或采用融合技术提高氨 基酸产量 ③维生素:构建基因工程菌,简化维生素的生产工艺(如Vit C)
方法,修饰或人工合成基因,按照设计改造天然蛋白质或酶,提高其应用价值。蛋 白质工程可以按照人类的需求创造出原来不曾有过、具有不同功能的蛋白质及其新
产品,或生产具有特定氨基酸顺序、高级结构、理化性质和生理功能的新型蛋白质,
可以定向改造酶的性能,生产新型功能性食品。
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蛋白质工程的应用:
构和性质非常相似,而其生物活性有时却相差很大
随着对各种抗生素生物合成途径的深入了解及基因重组技术的发 展应用基因工程技术可定向改造抗生素产生菌,获得只产生有效成分
的菌种
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四、改造抗生素生产工艺
1.抗生素产生菌一般对氧供应较敏感,供氧不足往往是高产发酵的限制 因素。在培养过程中,进入液相培养基的氧分子需穿过几层界膜,进 入菌体后,再经物理扩散,才能到达相应的呼吸细胞器。若在菌体内 导入血红蛋白基因,提高呼吸细胞器对溶氧的亲合力,从而提高细胞
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一、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法
1.抗生素(链霉素)生物合成基因的结构特点
① 链霉菌抗生素生物合成基因组的一个典型特性是G-C碱基组成,
(G+C)%高达70%以上;且三联体密码子中第3个碱基G、C比例极高 ②抗生素生物合成基因大多处于一个基因族中 ③抗生素生物合成基因除定位在染色体上外,有的定位于质粒上
形成基因重组体,然后把重组体引入宿主细胞内或个体中以得到高效表达,最终获 得人们所需要的基因产物,实现动物、植物、微生物等物种之间的基因转移,或
DNA重组,达到食品原料或微生物的改良。
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基因工程的应用:
1、优化食品生物资源及食品品质,即食品加工原料的改良
2、改良食品工业菌种,创造新型的工程菌
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3.通过调节基因的作用
调节基因的作用可增加或降低抗生素的产量,它常常是抗生素生 物合成和自身抗性基因族的组成部分。正性调节基因可加速抗生素的 合成,负性调节基因可降低抗生素的产量。因此,增加正性调节基因 或降低负性调节基因也是增加抗生素产量的方法
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4.增加抗性基因
抗性基因通过其产物灭活胞内或胞外的抗生素,保护自身免遭
相应的生物合成基因
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⑦同源基因杂交法
利用一种已经克隆的抗生素生物合成基因片段为探针,探测相关 抗生素同源基因,最后分离及克隆抗生素生物合成基因
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二、提高抗生素产量
在抗生素生产过程中,获得高产菌株的传统方法是通过诱变育种 得到的;而利用基因工程技术提高抗生素产量应从以下方面着手 1.将抗生素产生菌基因随机克隆到原株直接筛选高产菌株 原理:在克隆菌中,增加某一与产量有关的基因(限速阶段的正性调 节基因)的剂量,使产量提高
1、改善酶性质,提高酶活性和酶耐性