不同植物总DNA的提取及亲缘关系的研究班级：生物技术10-1摘要：核酸的分离纯化是核酸制备及分析的前提和基础，在本实验中我们小组成员将学会和掌握核酸制备的一些基本操作和方法，并通过分光光度法和电泳等实验技术研究核酸的性质，同时掌握用限制性内切酶酶解技术分析不同材料之间亲缘关系的方法。

关键词：核酸提取分光光度法电泳限制性内切酶酶解技术Absract:The nucleic acid separation purification is the premise which and the foundation the calculation prepares and analyzes, our panel members will learn and grasp the nucleic acid preparation in this experiment some elementary operation eos and the method, and through experiment engineering research nucleic acid's and so on spectrophotometric method and electrophoresis nature, simultaneously grasps with the restrictive interior contact enzyme enzymolysis technical analysis different material between the sibship method.Key words: nleic acid extractioucn spectrophotometry electrophoresis Restriction endonuclease enzyme of Enzymatic Hydrolysis technology1.绪论DNA是遗传的物质基础，分离纯化DNA是研究基因结构与功能的首要前提。

细胞内DNA是与蛋白质结合存在的。

在提取DNA的过程中必须将其中的蛋白质降解除去，同时需要尽可能保证其DNA分子的完整性，因此，必须在温和的条件下进行提取，注意避免核酸内切菌引起DNA的降解。

1.1植物组织中制备基因组DNA一般有下列几个策略：1.1.1细胞壁的破碎。

通常将植物组织放在研钵中与液氯或干冰粉末(用于冰时先将干冰碾成粉末)。

1.1.2细胞膜的破坏常用去污剂(如SDS或CTAB)。

1.1.3保护DNA免受内源核随菌的破坏，这包括多方面的措施。

去污剂的加入和EDTA 的存在都能破坏或抑制酶的活性，因EDTA是种整合剂，它能结合大多数核酸酶的辅因子Mg2+。

此外，用氮仿和苯酚乳化州A提取液时，同时也使蛋白质变性，分离蛋白质和DNA。

1.1.4尽量减少DNA的断裂。

即使溶液的振荡也会使DNA断裂，在操作中不特别小心的话，获得的DNA是50一100 kb。

1.1.5研磨植物组织时尽量保持在冰冻状态(掖氯或于冰中)，直至与提取经冲浪混合，以避免DNA的降解。

1.1.6高等植物材料往往含有多糖，面多糖常常是某些限制酶或连接菌的抑制剂，用CTAB的核酸提取法可得到纯的高相对分子质量的DNA，它利用核随和多糖在cTAB存在时溶解度不同面分离。

1.1.7在用异丙醉或乙醇沉淀植物组织DNA时，能观察到白色的纫纤丝及纤维团，若用钩子将所有的DNA都轻轻绕在钩子上取出并洗涤，这样得到的DNA与用离心沉淀法取得的DNA相比，前者的纯度更高些。

不同植物，不同组织，不同年龄的材料制备所得DNA 的产率也不同。

植物幼苗或嫩叶制备DNA容易且产率高。

1.2通常，利用质粒的大小和限制性酶切位点来鉴定质粒。

具体做法是：首先，选用一种或两种限制性核酸内切酶切割质粒；然后，进行琼脂糖凝胶电泳；最后，根据质粒的电泳迁移率和酶切图谱对质粒进行鉴定。

1.2.1限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某一特定核昔酸序列，并由此切割DNA双链结构的特殊核酸内切酶。

1.2.2琼脂糖凝胶电泳是鉴定质粒，特别是重组DNA分子的重要技术手段，同时，也被广泛用来分离、纯化特定的DNA片段。

琼脂糖凝胶电泳的分辨率取决于凝胶的浓度，浓度越高，凝胶的空隙越小，其分辨率也就越高；反之，浓度降低，空隙就增大，其分辨率也就随之降低。

1.2.3核酸分子带有许多负电荷，当它被放置在电场中时，会向正极移动。

在一定电场强度下，DNA分子移率的大小取决于其本身的大小和构型。

分子量较小的DNA分子比分子量较大的DNA分子更容易通过凝胶介质，故其迁移率较大，跑在前面。

所提取的质粒往往有三种构型：超螺旋、开环和线性。

电泳时，由于三者的紧密程度不同，所以，它们的迁移率并不相同。

一般情况下，具有超螺旋构型的质粒，由于其结构最为紧密，所以它的迁移率也就最大，跑在最前面；其次为具有线性构型的质粒；具有开环构型的质粒跑在最后。

质粒经限制性核酸内切酶切割后，其构型均为线性。

2．方法2.1实验仪器与试剂主要仪器器材：研钵、高速离心机、紫外分光光度计、水浴锅、微量加样器、电泳仪、紫外透射反射分析仪、试管、烧杯、试剂瓶、冰箱。

主要试剂：(1)提取缓冲液：100mmol/L Tris-HCl(pH值为8.0);20mmol/L EDTA；1.4mo1／L氯化钠；2％CTAB。

(2)TE缓冲液：10 mmol／L Tris—HCl(pH值为8.0);1mmo1／L EDTA。

(3)氯仿：异戊醇(24：1)。

(4)异丙醇。

(5)70％乙醇。

(6)TAE电泳缓冲液；40mmol/L Tris；20mmol/L HAC;lmmol/L EDTA。

（7）上样缓冲液：3.72克EDTA，20克Ficoll，0.25克溴酚蓝，溶解后定容至100ml 以上试剂均需用蒸馏水配制；缓冲液高压灭菌后于4摄氏度保存。

琉基乙醇在其他溶液组分灭菌后，使用之前加入。

2.2操作步骤2.2.1植物组织中DNA的分离(1)取新鲜植物嫩叶组织或芽1g，用蒸馏水冲洗干净后，置液氮中冷冻20一30 min，将冻结组织放入研钵中加液氮悬浮，研磨使其充分粉碎成细粉末。

倒入离心管中。

(2)加入4mL 60℃保温的提取缓冲液，50微升硫基乙醇，恒温水浴锅中60℃保温45min，其问缓慢颠倒4次。

(3)取出后，放入冰浴中，加400 微升0.015mol/l 乙酸钾，颠倒混匀，放置20 min。

不时摇动。

(4)4℃，8000 r／min离心15min，吸出含DNA的水相，放人另一离心管中。

(5)加入等体积的氯仿：异戊醇溶液，缓慢倒转混匀呈乳状，冰浴中放置20min。

(6)4℃，1000r／min离心15min。

上清吸入另一离心管中。

(7)加入0．6倍体积的预冷异丙醇，20℃放置10 min。

(8)用玻璃棒轻轻搅动两相界面，挑出白色沉淀，70％乙醇冲洗两次。

(9)风干，加入200微升TE溶解。

2.2.2 DNA合量和纯度检测(1)取两只0．5cm厚的石英比色杯。

加入3mL TE。

(2)一只作为对照杯，一只再加入7．5微升DNA样品作为检测管。

(3)读取OD280，OD260值和比值。

计算样品含量和纯度。

DNA含量(微升／mL)＝OD260／0.02×稀释倍数2.2.3限制性内切酶性质研究表2-33-1 （单位：uL）小青菜质粒DNA 10x酶缓冲液限制性内切酶双蒸水有酶切实验组 6 2 1 11无酶切对照组 6 2 —12混匀，37摄氏度水浴1—2小时。

日2.2.4 1.0%琼脂糖凝胶板制备(1)用配套挡板将凝胶塑料托盘短边缺口封住，置水平玻板或水平工作台面上，将样品槽模板插进长边上的凹槽内（距一边约1.5cm），梳齿底边与托盘表面保持0.5-1mm的间隙，安置好后保持静止状态。

（2）称取0.3克琼脂糖至于小锥形瓶中，加入30mlTAE稀释缓冲液，在电炉上加热融化，一定要煮沸两次排尽气泡。

（3）待琼脂糖冷却至约60摄氏度后，滴一滴gold view,然后将琼脂糖溶液在靠近挡板一侧连续地倒入托盘内，使凝胶缓慢而连续地展开直至托盘形成一层3mm厚均匀胶层。

胶内不要存有气泡，室温下静置约20分钟。

（4）待凝胶完全后，用小滴管在梳齿附近加入少量TAE稀释液润湿凝胶，用双手均匀用力轻轻拔出样品槽模板，则在胶板上形成相互隔开的样品槽。

（5）取下封边的挡板，将凝胶连同托盘放入电泳槽平台，倒入大量TBE稀释缓冲液直至浸没过凝胶面2-3mm，要防止样品槽内窝存气泡，可以用微量注射器挑除。

2.2.5 加样用微量注射器将经酶切的样品液和未经酶切的样品液（要加2微升的酶反应终止液）分别加入到凝胶板的不同加样槽内，每个槽加样不超过15微升。

加样时针头穿过缓冲液小心靠近加样槽底部，但不要损坏胶槽，然后缓慢将样品推进槽内，让其集中于槽底部。

2.2.6 电泳5V／cm电泳，当染料带移动到距离凝胶前约1cm时，停止电泳。

2.2.7 观察小心取出凝胶至托盘上，将胶板推置预先浸湿并铺在紫外灯观察台上的玻璃纸内，在波长为245nm紫外灯下进行观察。

DNA存在的位置成绿色荧光，可观察到清晰条带。

3．结果3.1OD280（小青菜）=0.007OD260（小青菜）=0.0093.2 DNA条带观察如下图.4．讨论OD260（小青菜）/OD280（小青菜）=1.29 <1.8由结果得知，4.1小青菜DNA样品属于蛋白质污染。

分析原因：a.由于设备问题，没有在低温（4摄氏度）下进行低温离心，影响了离心效果；b.在加异丙醇之后，会存在一层蛋白质沉淀；c.在将DNA沉淀挑出的过程中，会带上部分蛋白质沉淀。

d.试验中没有使用高效的蛋白质去除剂。

4.2稀释倍数：3000／7.5 =400DNA含量[小青菜](微升／mL)＝OD260／0.02×稀释倍数=0.009／0.02×400=180(微升／mL)分析原因：a.操作问题，没有捣碎充分b.由于设备问题，没有在低温（4摄氏度）下进行低温离心，会引起DNA降解c.在加入异丙醇之后，摇晃过于剧烈，使得DNA降解。

d.在提取离心过程中，次数过多，将DNA洗去。

e. 缓冲液PH值不合适。

4.3 DNA条带模糊。

分析原因：a.在操作过程中由于试剂和仪器以及操作方法的问题，使得DNA降解，导致DNA分解成很多碎片，不能够集中跑电泳。

b.试验中使用的是gold view显色剂，显色效果较EB差。

c. 提取不干净，自配缓冲液PH不合适。

d. 与内切酶的反应时间过短（用了2个小时）5．参考资料石庆华.生物化学实验指导[M].北京：中国农业大学出版社，20069：162-168.邓天龙.生物化学实验[M].四川：电子科技大学出版社，20069:43-45。