— +EGF
— +EGF
800 nm channel
ERK
700 nm channel
phospho ERK
700 and 800 nm
Results Overlaid
EGF刺激后A431细胞，ERK1 and ERK2 (p44/42 MAP kinases) 磷酸化情况, 一抗分别是兔抗ERK抗体和小鼠 抗磷酸化ERK抗体,二抗用抗兔的IRDye800 标记的抗体 (green),和抗鼠的 Alexa680 标记的抗体 (red)。叠加后 为黄色，黄色的深浅即代表了磷酸化水平的高低，并且可以通过软件进行准确的量化分析。
Pearl活体成像流程简单
EGF-IRDye 800CW probe
Custom labeling
HA
2dGlucose IRDye 800CW probe
IRDye800CW
RGD-IRDye 800CW
PEG-IRDye 800CW probe
BoneTag-IRDye 800CW
CellVue NIR815 cell stain
11/10/2012
红外荧光－直接检测
Infrared dye (IRD800, Alexa680)
膜上抗原
一抗结合
不需要底物 不需要底片/暗室 信号持久
红外标记的二抗
Odyssey直接扫描
Odyssey—双色同时检测
• 两套独立激发检测系统 • 700通道：680nm激发 720nm检测 • 800通道：780nm激发 820nm检测
近红外荧光法
• 近红外荧光法能检测到0.6pg的蛋白（灵敏度高） • 近红外荧光成像呈现一个很好的线性（定量准确）
Moose Imaging – Signal/Background
Background
High S/B
Low S/B
近红外：低背景，高信噪比
近红外荧光的波长范围在700-800 nm之间，避开了NC膜、PVDF 膜微孔板等耗材的本底信号，提高了检测的信噪比和相对灵敏度
信号恒定，准确定量 荧光成像 膜上直接观察到Marker 两种蛋白同时检测
近红外荧光成像技术
• 荧光——准确定量、线性范围宽广 • 红外——背景低、信噪比高 • 双色——同时检测、同时输出
荧光－准确定量
化学发光
• 动态信号－信号随时间变化 • 信号不与目标蛋白浓度成比例关系
荧光
• 静态信号－信号不随时间变化 • 信号和目标蛋白浓度成比例关系
800 nm
Better Excitation Efficiency
800 nm
Cleaner Detection
LEGEND
Better Sensitivity
Absorption Spectra of Dye Emission Spectra of Dye Li2
In-Cell Western Assay
细胞处理效果和药物筛选的最佳选择
In-Cell Western Assay 快速、高通量、重现性好
细胞培养 细胞刺激 固定和透化 细胞裂解
上样 电泳 转膜 孵育抗体 成像 通量
膜上Western
√ √
√ √ √ √ √ √ 12 sample/Gel
NIR EMSA - 告别同位素！
（体外核酸和蛋白相互作用）
700 nm Channel
700 and 800 Overlay
DNA-Protein Complex Unbound DNA IRDye 800 Unbound DNA IRDye 700
800 nm Channel
Binding of T7 RNAP to two DNA fragments containing the T7 promoter sequence, labeled with either IRDye 700 (red) or IRDye 800 (green).
Saturation
INTENSITY
Background 0,0
TIME
High concentration / signal
0,0
Medium concentration / signal
TIME
Low concentration / signal
红外荧光 VS 化学发光
定量线性范围更宽
化学发光法
Source Excitation Light
Quality of Light
Excitation Efficiency
Background Noise
Overall Performance
800 nm
800 nm
800 nm
800 nm
NIR Laser Benefit
Lower Power
More Light
In-Cell Western √ √ √
√ √ 96或384/Plate
11/10/2012
NIR - 小动物活体成像
低
GFP
RFP
IRDye®
高
背
信
景
噪
比
11/10/2012
• 组织和细胞对近红外波长的光信号吸收最低 • 红外波段，光的散射更低 • 在近红外波长范围，自发荧光更低
波长特异性激光器作为激发光源
近红外荧光成像平台
Odyssey Fc
Odyssey CLx
Odyssey Sa
Pearl
近红外荧光成像的权威！
11/10/2012
总结
• 准确定量 —提供更完善的数据，提升文章档次 • 成像效果好 —背景低，条带清晰，没有吹泡现象 • 双色检测 —靶蛋白+总蛋白+Maker 同时检测 • 成本低 —无需底物，无需胶片，无需暗室，二抗
注射Pan-IR700 300µg的第一天即接种A431-HER1肿瘤细 胞系的第5天（此时肿瘤的大小已经长到＜500mm³）， 用IR照射小鼠，发现A431肿瘤体积明显减小。
IRDye800CW-coupled Fe3O4 nanoparticles 进行细胞标记和活体成像
J Nanobiotechnology. 2010 Oct 29; 8:25. Manufacture of IRDye800CW-coupled Fe3O4 nanoparticles and their applications in cell labeling and in vivo imaging. Hou Y, Liu Y, Chen Z, Gu N, Wang J. State key Laboratory of Bioelectronics, Southeast University, Nanjing 210096, China. wangjinke@.
近红外荧光成像技术
- 定量Western Blot的新标准
基因有限公司 李春燕
化学发光检测
近红外荧光检测
680 laser
800 laser
11/10/2012
化学发光检测
红外荧光检测
酶促化学反应，无法准确定量 暗房曝光 膜上无法直接观察到Marker 两种蛋白检测需Strip
11/10/2012
稀释倍数高
• 扩展应用 —ICW，EMSA，小动物活体成像等 • 近红外荧光系统平台市场占有率高，发表文献多
11/10/2012
Thank you!
11/10/2012
800 nm
700 nm
Overlay
双色－定量western检测
Target protein Anti-rabbit 800 channel
Normalizer target Anti-mouse 700 channel
11/10/2012
杂交条件均等，结果同时输出，直接比对
双色－蛋白磷酸化
— +EGF