MicroStar的优缺点
• 优点：缩短培养时间，提高灵敏度。适 合于菌数较低的可过滤产品使用。
• 缺点：仪器较昂贵，运行成本也非常贵。 不能用于检测未知的可能菌数较高的样 品(不知稀释多少倍，因菌数必须稀释至 80个左右)。整个检测时间还不够快，通 常需16小时以上。
（二）电化学方法(电导率法或电阻抗法)
快速检测方法势在必行！！
• 国外许多政府检测机构都在大量使用快速检测 方法，尤其是ATP法、免疫法、阻抗法和显色 培养基法在国外应用相当成功。
• 国内的许多政府检测机构也都已经在使用或正 在考虑使用国外先进的快速检测技术。
• 从长远发展趋势来说，快速方法是微生物检测 的一大方向。
一、常规微生物快速检测技术现状
• 传统计数改良法： 1、螺旋平板计数法：螺旋接种仪＋菌落计数 2、滤膜法：常用于一些可过滤样品的检测。 3、纸片法：培养基固定在载体上。省去制做
培养基的时间。主要用于细菌总数检测。 4、其它：如Simplate即用胶,改良M接种仪
aColyte自动菌落计数仪
螺旋平板原理
• 优点：LUM-96通常用于进行商业无菌检测。 可大大缩短库存时间，减少物流压力和成本。
• 缺点：ATP方法需要消耗大量的较昂贵的试剂， 对仪器的清洗保养要求特别高。另外，客户通 常怀疑假阴性的可能，特别是用ATP单个检测 代替常规微生物和致病微生物检测，其风险是 一定存在的。(如保温增菌时间不够，菌数未达 到一定数量，取样量太小，由于培养基原因， 目标致病菌未大量增菌等原因)
• 缺点：不能节省检测时间。检测成本相对偏高。 大肠菌群纸片存在与MPN法无法对应的问题， 金黄色葡萄球菌纸片存在取样量太低的问题。目 前仅细菌总数纸片有一些用户。
其它即用胶，MPN改良法
Simplate
colilert
主要用于 水样或澄 清样品的 大肠菌群 或大肠杆 菌检测
• SimPlateTMTPC 法：基于食源性细菌的蛋白 质有特异性酶类，TPC培养基内含有多种细菌 酶类所对应的底物。检样被细菌污染时，只要 具有一种酶的活性即能与底物作用生成4-甲基 伞形酮，培养24h后，在紫外线照射下，发出 蓝色荧光。
2、改良后用于食品、化妆品的商业无菌 检测或终产品检验。
LUM－T清洁程度快速检测
1)将水样在玻璃纤维过滤器上过滤以便富集微生物； 2)用适当的溶解剂溶解细胞； 3)用适当的萃取剂萃取ATP； 4)将ATP的萃取液加到盛有萤光素、萤光素酶的试管中， 并用光度计记录下所产生光的量，将此读数和ATP浓度标 准曲线相比较，就可得到待测样品中ATP含量；用得到的 ATP含量确定水样中细菌数量。
二、常规微生物快速检测技术现状
• 快速检测微生物数量的新方法： 1、ATP法：目前产品较多，如CHARM，
Biotrace, …..等。 2、电化学法：Sy-Lab公司Bactrac 4300，Tempo,… 3、颜色变化：如梅里埃的Bact/Alert和Foss的
MicroFoss。 4、流式细胞技术及激光扫描技术 5、其它：热量法，放射测量法
政府检测机构为什么需要微生物 快速检测？
日益严峻的食品安全局势的需要
•
•
提国生内 。高外检食测品安效全率形势严峻，恶性事件不断发
••
节欧洲约“人二力噁英资”源、“成疯本牛病”（20世纪90
年代）
•• 与日本国大际肠接杆菌轨O157:H7中毒（1996）
• 中国SARS（2003） 、东南亚国家禽流感 （2004）
• 是目前国际上正在认可的生物荧光定量检测微 生物数量的两种方法之一。另一种是Millipore 的一款叫MicroStar的基于ATP检测的产品。
荧光酶标记原理
•直接单细胞标记 (包括孢子) •细胞无增菌要求 •标记在90分钟内完成 •直接对活细胞和酵母进行标记
标记的细菌
标记后的酵母
标记后的霉菌
接种针往外移动 同时自动将样品 稀释1000倍
平皿旋转
螺旋平板法的优缺点
• 优点： 与传统方法相比，无需稀释3个梯度， 每个梯度倒2个平板，节省了大量人力物 力。
• 缺点： 检测时间并没有缩短，菌落总数仍需要 培养48小时。 需要配合自动菌落计数仪，否则人工计 数更麻烦。
滤膜法
• 滤膜法常用于可过滤样品的微生物检测。 • 优点：灵敏度增大，菌落无扩散情况，
• 食源性细菌悬浮于TPC培养基表面，在分隔的 小池内能迅速进行生化反应，若有检样颗粒亦 无干扰；它不是由48h形成的菌落来计数，而 是24h后在紫外灯照射下记录培养皿内能发出 蓝色荧光的阳性池数，进而由最大近似值 (MPN) 表查出细菌的MPN。阳性池数与 MPN 呈松泊分布。
• 固定底物技术酶底物法，需要coliert试 剂
方法较新，用户还需 要一个过程了解。
（三）流式细胞技术及激光扫描技术
流式细胞计数技术
流式细胞 :
线性流体 单细胞分析 灵敏的检测头
用于非过滤产品 流式细胞术（FCM）是对于处在快速直线流动状态中的细胞 或生物颗粒进行多参数的、快速的定量分析和分选的技术
FOSS公司 BactoScan FC牛奶中总菌数快速检测仪
基于ATP原理的用于成品检测的 微生物检测系统
• Charm LUM-96 （用于UHT产品-高温 瞬间灭菌）
• Biotrace • Celsis（主要用于化妆品） • Millipore公司的MicroScan
Celsis和LUM-96
保温2天，检测30分钟（96个样）
ATP法检测成品的优缺点
• 美国Chemunex公司将流式细胞技术与活细胞荧 光探针标记及激光扫描技术相结合，推出的最 新一代的速度更快的Bactiflow以及更高端的 ScanRDI和D-count微生物快速检测仪。
• 其最大的特点是只检测活细胞数，速度极快， 处理量大。与FOSS的BactoScan FC检测死活细 胞都检测不同。
• 奥地利Sylab公司的Bactrac4300和 Biotrac4200
• 梅里埃公司的Bactometer和Tempo • 英国Multhus公司(已倒闭) • 英国DWS公司的Rabit • ……
外观比较
Bactrac4300 梅里埃的BactoMeter
DWS公司的Rabit 马色斯120
世界上最好的电化学微生物快速检测产品 Bactrac 4300系统
Sy-lab —Bactrac4300常规微生物项目快速检测技术
MicroFoss(Biosys) 微生物自动监测仪
微生物生长导致培养基 pH值发生变化，由光学 检测器检测底部琼脂层 的颜色变化，记录达到 突变点的时间。
Microfoss的特点
表面洁净的检测方法
• 微生物学法：纸片、琼脂板、 棉签拭子、海绵拭子
• 非微生物学法（快速法）： ATP(三磷酸腺苷，蛋白质, 降 解糖、NADP(辅酶II)，其它。
（一）ATP法 ATP---三磷酸腺苷
ATP来源于
细菌 酵母 霉菌 生物膜 组织残留
废弃物污染 人的污染
1. 人接触设备或器具 2. 设备或器具被污染 3. 清洗不正常 4. 非正常的敏感物污染 5. 微生物污染
Laser scanning
Microscope Confirmation
Bactiflow
适合实验室或研 究用 日处理量不大于 40个样品
D－Count 适合实验室或生 产现场使用 日处理量大于40 个样品的场合
Real-time analyser D-count
标记和检测原理
细胞标记
12 minutes
8、微生物的快速检测
常见微生物检测项目
常规微生物项目：细菌总数、大肠菌群、 大肠杆菌、酵母总数、霉菌总数。
致病微生物项目：沙门氏菌、李斯特菌、 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157：H7、 弯曲杆菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志 贺氏菌、假单胞菌等。
• 国家标准GB/T 4789 1-40：食品卫生微生物 学检验：菌落总数测定、大肠菌群计数、沙门 氏菌检验、志贺氏菌检验、致泄大肠埃希氏菌 检验、副溶血性弧菌检验、小肠结肠炎耶尔森 氏菌检验、空肠弯曲菌检验、金黄色葡萄球菌 检验、溶血性链球菌检验、肉毒梭菌及肉毒毒 素检验、产气荚膜梭菌检验、蜡样芽孢杆菌检 验、霉菌和酵母菌计数、常见产毒霉菌的鉴定、 椰毒假单胞菌酵米面亚种检验、单核细胞增生 李斯特氏菌检验、肠杆菌科噬菌体检验、大肠 菌群快速测定、双歧杆菌检验、乳酸菌检验、 大肠埃希氏菌O157：H7/NM检验、阪崎肠 杆菌检验等。
检测原理
荧光素 荧光素酶
ATP+ O2+ Luci f er i n+ Luciferase =
氧合荧光素
Oxyl uci f er i n+ AMP+ PPi+ CO2
腺苷一磷酸 荧光
ATP法两大用途
1、用于食品、化妆品和药品企业对生产 线和管道进行快速清洁程度检测。政府 检测机构用ATP方法缺乏法律依据。ATP 法与微生物数量没有必然的联系。
• 与阻抗法类似，可以实现快速检测。
• 缺点：需要购买原厂的预装培养基，应 用范围受限制，成本高昂。因此在我国 目前还没有用户。
梅里埃的BacT/Alert微生物检测仪
基于微生物生成产生CO2的原 理。CO2积累越多，底部的 CO2传感器变黄，由LED发射 一束光至底部，探头检测反射 光的强度。光强度与微生物数 量有一定关系。
Millipore公司最新推出的MicroStar
MicroStar的原理及局限性
• MicroStar快速微生物检测系统是结合了 生物荧光、膜过滤及CCD荧光照相检测 等技术的新型检测系统.
• 可过滤样品经膜过滤后，将菌截留在特 殊的滤膜上，滤膜放置在培养基表面增 菌后取出，加ATP释放剂，然后加荧光素 和荧光素酶，显示的荧光信号在荧光显 微镜或荧光检测器下观察并计数。