• 缺点：不能节省检测时间。检测成本相对偏高。 大肠菌群纸片存在与MPNபைடு நூலகம்无法对应的问题， 金黄色葡萄球菌纸片存在取样量太低的问题。目 前仅细菌总数纸片有一些用户。
其它即用胶，MPN改良法
Simplate
colilert
主要用于 水样或澄 清样品的 大肠菌群 或大肠杆 菌检测
• SimPlateTMTPC 法：基于食源性细菌的蛋白质 有特异性酶类，TPC培养基内含有多种细菌酶 类所对应的底物。检样被细菌污染时，只要具 有一种酶的活性即能与底物作用生成4-甲基伞 形酮，培养24h后，在紫外线照射下，发出蓝 色荧光。
• 采用大肠菌群细菌能产生D-半乳糖苷酶 分解ONPG（邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷） 使培养液呈黄色，以及大肠埃希氏菌产 生D-葡萄糖醛酸酶分解MUG（4-甲基伞形 酮-D-葡萄糖醛酸苷 ）使培养液在波长 366nm紫外光下产生荧光的原理，来判断 水样中是否含有大肠菌群及大肠埃希氏 菌。只需24小时即可同时定量出水样中 大肠菌群和大肠埃希氏菌的MPN值。
• 美国菠菜大肠杆菌O157:H7污染事件（2019）
企业为什么需要微生物快速检测？
• 市场销售环节要求快速出货。尤其是一些保质 期较短的产品。
• 减少物流的压力，尽可能减少仓存，加快资金 周转。
• 节约人力资源成本（外资企业尤其突出） • 对于运行HACCP质量保证体系的企业来说，快
速检测方法尤其重要。可以快速检测原料及半 成品的污染情况，以采取相应的措施控制最终 产品的微生物超标情况。
表面洁净的检测方法
• 微生物学法：纸片、琼脂板、 棉签拭子、海绵拭子
• 非微生物学法（快速法）： ATP(三磷酸腺苷，蛋白质, 降 解糖、NADP(辅酶II)，其它。
（一）ATP法
ATP---三磷酸腺苷
ATP来源于
细菌 酵母 霉菌 生物膜 组织残留
废弃物污染 人的污染
1. 人接触设备或器具 2. 设备或器具被污染 3. 清洗不正常 4. 非正常的敏感物污染 5. 微生物污染
8、微生物的快速检测
常见微生物检测项目
常规微生物项目：细菌总数、大肠菌群、 大肠杆菌、酵母总数、霉菌总数。
致病微生物项目：沙门氏菌、李斯特菌、 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157：H7、 弯曲杆菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志 贺氏菌、假单胞菌等。
• 国家标准GB/T 4789 1-40：食品卫生微生物学 检验：菌落总数测定、大肠菌群计数、沙门氏 菌检验、志贺氏菌检验、致泄大肠埃希氏菌检 验、副溶血性弧菌检验、小肠结肠炎耶尔森氏 菌检验、空肠弯曲菌检验、金黄色葡萄球菌检 验、溶血性链球菌检验、肉毒梭菌及肉毒毒素 检验、产气荚膜梭菌检验、蜡样芽孢杆菌检验、 霉菌和酵母菌计数、常见产毒霉菌的鉴定、椰 毒假单胞菌酵米面亚种检验、单核细胞增生李 斯特氏菌检验、肠杆菌科噬菌体检验、大肠菌 群快速测定、双歧杆菌检验、乳酸菌检验、大 肠埃希氏菌O157：H7/NM检验、阪崎肠杆菌检 验等。
政府检测机构为什么需要微生物 快速检测？
日益严峻的食品安全局势的需要
•
•
提国生内。高外检食测品安效全率形势严峻，恶性事件不断发
••节欧洲约“人二力噁英资”源、“成疯本牛病”（20世纪90年
代）
••与日本国大际肠接杆菌轨O157:H7中毒（2019）
• 中国SARS（2019） 、东南亚国家禽流感 （2019）
• 传统计数改良法： 1、螺旋平板计数法：螺旋接种仪＋菌落计数 2、滤膜法：常用于一些可过滤样品的检测。 3、纸片法：培养基固定在载体上。省去制做
培养基的时间。主要用于细菌总数检测。 4、其它：如Simplate即用胶,改良MPN产品。
螺旋平板法
DWS螺旋平板接种仪
aColyte自动菌落计数仪
螺旋平板原理
检测原理
荧光素 荧光素酶
ATP+ O 2+ Lu ci f e r i n + Lu ci f e r a se =
氧合荧光素
O x y l u ci f e r i n + A M P+ PPi + CO 2
腺苷一磷酸 荧光
ATP法两大用途
1、用于食品、化妆品和药品企业对生产 线和管道进行快速清洁程度检测。政府 检测机构用ATP方法缺乏法律依据。ATP 法与微生物数量没有必然的联系。
• 食源性细菌悬浮于TPC培养基表面，在分隔的 小池内能迅速进行生化反应，若有检样颗粒亦 无干扰；它不是由48h形成的菌落来计数，而 是24h后在紫外灯照射下记录培养皿内能发出 蓝色荧光的阳性池数，进而由最大近似值(MPN) 表查出细菌的MPN。阳性池数与MPN 呈松泊分 布。
• 固定底物技术酶底物法，需要coliert试 剂
二、常规微生物快速检测技术现状
• 快速检测微生物数量的新方法： 1、ATP法：目前产品较多，如CHARM，
Biotrace, …..等。 2、电化学法：Sy-Lab公司Bactrac 4300，Tempo,… 3、颜色变化：如梅里埃的Bact/Alert和Foss的
MicroFoss。 4、流式细胞技术及激光扫描技术 5、其它：热量法，放射测量法
接种针往外移动 同时自动将样品 稀释1000倍
平皿旋转
螺旋平板法的优缺点
• 优点： 与传统方法相比，无需稀释3个梯度，
每个梯度倒2个平板，节省了大量人力物 力。 • 缺点：
检测时间并没有缩短，菌落总数仍需 要培养48小时。
需要配合自动菌落计数仪，否则人工 计数更麻烦。
滤膜法
• 滤膜法常用于可过滤样品的微生物检测。 • 优点：灵敏度增大，菌落无扩散情况，
便于计数。
• 缺点：需要额外的支出购买真空泵，多 联支架及一次性滤膜；如果抽滤过程空 气洁净度不够，有可能造成二次污染， 尤其是对菌数要求特别严格的产品，如 啤酒，澄清果汁，桶装饮用水等。
皿膜法—以纸片法为代表
•纸片法是目前被广泛接受的方法。国标 餐具大肠菌群采用的就是纸片法。
• 优点：无需制备培养基，携带方便，非漫延菌落 计数较方便。
快速检测方法势在必行！！
• 国外许多政府检测机构都在大量使用快速检测 方法，尤其是ATP法、免疫法、阻抗法和显色 培养基法在国外应用相当成功。
• 国内的许多政府检测机构也都已经在使用或正 在考虑使用国外先进的快速检测技术。
• 从长远发展趋势来说，快速方法是微生物检测 的一大方向。
一、常规微生物快速检测技术现状