第一节微生物的分离和纯培养
一、培养基
1．含义
由于微生物代谢方式的不同，因而对营养物质的需求也是有差异的。

根据微生物生长繁殖和代谢的需要，将各种营养物质混合在一起而配制的营养基质。

2．平板培养基
将溶化后的固体培养基基质倒入无菌培养皿中，冷却凝固后制成的培养基。

二、无菌技术
1．目的和要求
在微生物的分离和纯培养中，一定不能有外来的污染性杂菌，所以必须采用无菌技术进行操作。

因此，在实验过程中，要对所用的器材、培养基进行严格的灭菌，对工作场所要进行消毒。

2．灭菌和消毒
(1)灭菌：用强烈的理化因素杀死环境或物体内外所有的微生物，常用的方法是高温灭菌法。

(2)消毒：用相对温和的理化方法杀死环境或物体上的病原微生物和有害微生物的营养细胞，常用的方法是射线消毒法和化学药剂消毒法。

三、接种技术
1．含义
把相应的研究对象移入培养基中的过程。

2．分类
在平板培养基上接种的方法有平板划线法、稀释涂布平板法、稀释混合平板法等。

一、微生物的概念及特点 1．概念
微生物是一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称。

2．特点
微生物⎩
⎪⎪⎪⎨⎪⎪⎪⎧小（个体微小）⎩
⎨⎧μm （微米）级：光学显微镜下可见（细胞）nm （纳米）级：电子显微镜下可见
（细胞器、病毒）
简（构造
简单）
⎩⎨⎧单细胞简单多细胞非细胞（分子生物）
低（进
化地位低）
⎩⎨⎧原核类：细菌、放线菌、支原体、立克次氏体、
衣原体、蓝细菌真核类：真菌（酵母菌、霉菌）、原生生物非细胞类：病毒、类病毒、朊病毒
二、微生物的营养及功能
微生物的化学组成成分与其他生物大体相同，也是由C 、H 、O 、N 、P 、S 等元素组成的，其中C 、H 、O 、N 占细胞干重的90%以上，这些元素最终来自外界环境中的各种无机化合物和有机化合物。

这些化合物可归纳成碳源、氮源、生长因子、无机盐和水这五大类营养要素。

(1)微生物最常利用的碳源是糖类
1．实验原理
微生物的分离与纯化就是将待检测微生物样品通过划线或涂布接种在固体培养基上，样品中的每一个细胞或孢子都可以生长繁殖形成单个菌落。

将单个菌落接种到斜面培养基上，经培养后，即可得到一个微生物的纯种。

2．材料用具
培养16～24 h的大肠杆菌(E.coli)培养液，灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(斜面和平板)，盛有9 mL无菌水的试管，无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环等。

3．方法步骤
微生物的分离包括样品稀释、划线或涂布及培养三个步骤。

微生物分离操作流程图
(1)稀释：用1 mL无菌吸管吸取1 mL大肠杆菌培养液，加入盛有9 mL无菌水的大试管中，充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1 mL加入另一支盛有9 mL无菌水的试管中，混合均匀，依次制成10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6系列稀释度的大肠杆菌稀释液。

(2)划线或涂布
①平板划线分离法：在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，沾取大肠杆菌培养液在平板上划线，常用的划线方法有交叉划线和连续划线两种(如下图)。

交叉划线时，每转一个角度灼烧一次接种环。

划线完毕后，盖上培养皿盖，做好标记。

划线法示意图
②涂布分离法：取3个平板，底面分别用记号笔写上10－4、10－5和10－6三种稀释度，然后用无菌吸管分别吸取相应稀释度的稀释液各0.1 mL，放入已标记好的平板上，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置5～10 min，使菌悬液吸附进培养基(如下图)。

涂布法示意图
(3)培养：将划线或涂布接种的平板倒置于培养箱或温室中37 ℃培养16～24 h，即可长出单个的菌落。

四、平板划线操作应注意的问题
第一次划线及每次划线之前都需灼烧接种环灭菌，划线操作结束仍需灼烧接种环，每次灼烧的目的如下表：
(1)灼烧接种环之后
(2)此培养液能否用于植物的无土栽培？________，理由是__________，若用于无土栽培，还应注意培养液中________的含量。

(3)若除去①，加入(CH2O)，该培养基可用于培养__________。

[解析]培养基中未提供碳源，据此可判定该生物应为自养型，但对植物来说，无土栽培时所用培养液必须是全素(含所有必需元素)培养液，因此，该培养液不可直接用于植物的无土栽培。

从培养基中除去(NH4)2SO4(氮源)，加入(CH2O)(有机碳源)，该培养基可用于培养固氮微生物。

[答案](1)自养型微生物
(2)不能缺乏Mg等矿质元素氧气
(3)固氮微生物
自养型微生物和异养型微生物的营养比较
下列关于培养基配制的说法，不正确的是()
A．配制的培养基需要进行灭菌
B．微生物的适应性强，配制培养基时可以不考虑pH
C．虽然各种培养基的具体配方不同，但一般都含有碳源、氮源、水和无机盐D．配制培养基时要注意各种养分的浓度和比例
B[pH影响微生物的生长、代谢和繁殖，因此配制培养基时pH一定要适宜。

]
小组依照下列实验方案(如图a)筛选出能高效降解氯苯的微生物SP1菌，培养基配方如表b。

图a
表b培养基的组成
A．图中有筛选作用的只有Ⅱ号培养基
B．Ⅱ号、Ⅲ号培养基中无碳源只能培养自养微生物
C．Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号培养基中氯苯含量逐渐增加，是为了逐步选择降解氯苯能力强的微生物
D．微生物中原来就存在能降解氯苯的SP1菌，因此可以直接用Ⅲ号培养基进行一次性选择
[审题导析]
[解析]Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号培养基都对SP1菌有筛选作用；从培养基配方可以看出，Ⅱ、Ⅲ号培养基的碳源为氯苯；Ⅲ号培养基中氯苯的含量太高，直接使用，可能
无法得到SP1菌(自然状态下具高效降解能力的变异很少)。

[答案] C
上题将SP1菌接种在含不同浓度氯苯的Ⅲ号培养基中培养，得到生长曲线(如下图)，下列叙述不正确的是()
A．随着氯苯含量升高，SP1菌体数增多
B．在20 mg/L氯苯的培养基中菌体数最先达到最高
C．氯苯为SP1菌提供碳源
D．SP1菌在只含氯苯的培养基中就可以生长
D[培养基中除了含有氯苯外，还应含有氮源、无机盐等营养物质。

]
1．据食品产业网报道，近些年出现的一种膨化食品，合格率仅为76.2%，这两年不断有名牌企业出现食品质量问题，其主要原因大部分为铝含量超标，以及微生物超标。

下列关于微生物的叙述中，正确的是()
A．所有的微生物都是形体微小、结构简单、对人类有害的
B．微生物包含了除动物界、植物界的其他生物
C．微生物的结构简单到没有细胞核
D．微生物的结构简单到没有细胞结构
[答案] B
2．下列有关平板划线法操作的叙述，不正确的是()
A．第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物
B．每次划线前，灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种
C．在每一区域内划线时，接种环上的菌种直接来源于菌液
D．划线结束后，灼烧接种环，能及时杀死接种环上的菌种，避免细菌污染环
境和感染操作者
C[在用平板划线法分离大肠杆菌的实验中，接种环取菌种前灼烧的目的是避免接种环上可能存在的微生物污染培养物。

以后每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线后残留的菌种；划线结束后仍需灼烧接种环，是为了避免细菌污染环境和感染操作者。

从第二次划线开始，每次划线时接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端。

]
3．(2019·全国卷Ⅲ)回答下列与细菌培养相关的问题。

(1)在细菌培养时，培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是________(填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaNO3”)。

通常，制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH，其原因是____________________________________________________________。

硝化细菌在没有碳源的培养基上__________(填“能够”或“不能”)生长，原因是
________________________________________________________________________
__________________________________________。

(2)用平板培养细菌时一般需要将平板________(填“倒置”或“正置”)。

(3)单个细菌在平板上会形成菌落，研究人员通常可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物，原因是_______________________________________。

(4)有些使用后的培养基在丢弃前需要经过________处理，这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物。

[答案](1)蛋白胨不同细菌生长繁殖所需的最适pH不同能够硝化细菌可以利用空气中的CO2作为碳源
(2)倒置
(3)在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征
(4)灭菌。