不同限制性核酸内切酶对质粒DNA的切割
——限制性核酸内切酶EcoRI对pUC19-P35S:ARF8切割
摘要：【目的】为加深对限制性核酸内切酶和质粒DNA的酶切关系的认识，采用限制性核酸内切酶EcoRI对质粒DNA进行切割，从而验证不同限制性核酸内切酶对质粒DNA具有不同的切割结果。
【方法】采用限制性内切酶EcoRI对pUC19-P35S:ARF8进行切割，再用0.8%琼脂糖凝胶电泳加以分离，得到电泳图谱，对照分子量标样加以鉴定。
【结果】经琼脂糖凝胶电泳后，结果获得两条分子量不同的DNA带。
【结论】结果表明，用不同限制性核酸内切酶对质粒DNA 进行切割，可将质粒DNA切割成不同长度的DNA片段。
关键词：限制性内切酶EcoRI 质粒DNA 凝胶电泳酶切图谱
引言：没有限制性核酸内切酶的发现和应用，就没有分子生物学的兴旺发展，在基因工程和分子生物学中，限制性核酸内切酶起着其足轻重的作用。
限制性核酸内切酶均来源于原核生物，用于抗击外来DNA的入侵。
限制性核酸内切酶，能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA的酶，既是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶。
因此研究限制性核酸内切酶对质粒DNA的切割具有重要的意义。
材料和方法：
1．材料
1.1 重组质粒pUC19-P35S:ARF8由广州大学生命科学学院生化楼分子生物学实
验室构建
1.2 限制性内切酶：EcoRI购自TaKaRa等生物工程公司
1.3 琼脂糖：进口分装
2．设备
2.1 DYY-6C型电泳仪购自北京市六一仪器厂
2.2 0.1-2.5ul、0.5-10ul、5-50ul移液枪购自北京市六一仪器厂
2.3 ECFOII手掌型离心机购自碧云天生物技术研究所
2.4 EDC-810基因扩增仪、微波炉、凝胶成像系统等。
3．试剂
3.1 5 x TBE电泳缓冲液
3.2 6 x 电泳载样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液，贮存于4℃；
3.3 溴化乙锭溶液母液：将EB配臵成10mg/ml，用铝箔或黑纸包裹容器，储
于室温；
3.4 DNA分子量标准：从小到大为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp。
4．操作步骤
4.1 DNA酶切反应
4.11 将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管编号，用微量移液枪分别加入DNA 1ug和相应的限制核酸内切酶反应10 x 缓冲液2ul，再加入重蒸水使总体积为19ul，将管内溶液混匀后加入1ul酶液，用手指轻弹管壁使溶液混匀，使溶液
集中在管底。
此步操作是整个实验成败的关键，要防止错加，漏加。
使
用限制性核酸内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。
4.12 混匀反应体系后，将eppendorf管臵于适当的支持物上，37℃水浴保温
2-3小时，使酶切反应完全。
4.13 每管加入2ul 0.1mol/L EDTA(pH8.0)，混匀，以停止反应，臵于冰箱中保
存备用。
4.2 琼脂糖凝胶的制备
4.21 取5xTBE缓冲液20ml加水至200ml，配臵成0.5xTBE稀释缓冲液，待用。
4.22 胶液的制备：称取0.6-0.7g琼脂糖，臵于200ml锥形瓶中，加入80ml
0.5xTBE稀释缓冲液，放入微波炉里加热至琼脂糖全部融化，取出摇匀，
此为-0.8%琼脂糖凝胶液。
加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。
加热时应盖上封口膜，以减少水分蒸发。
4.23 胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏紧密封住。
将封好的胶
槽臵于水平支持物上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙，将冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入EB溶液时期终浓度为0.5ug/ml。
用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧，待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。
倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀，速度也不可太快，否则容易出现气泡。
待胶完全凝固后拔出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入0.5xTBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。
因边缘效应样品槽附近会有一些隆起，阻碍缓冲液进入样品槽中，所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。
4.24 加样：取10ul酶解液与2ul 6x载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品
槽中。
上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
4.25 电泳：加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。
控制电压保持在60-80V，
电流在40mA以上，电泳30分钟。
4.26 观察和拍照：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察已加有EB的电泳
胶板，DNA存在处显示出肉眼可变的荧光条带。
结果和分析：
如图1所示，用限制性核酸内切酶EcoRI对重组质粒pUC19-P35S:ARF8进行切割，经琼脂糖凝胶电泳后，获得了两条不同的条带图谱，对照DNA Maker 的分子量，可知这两个条带图谱的分子量均大于2000bp，其中有一个条带图谱的分子量约为2703bp。
图1 限制性核酸内切酶EcoRI与重组质粒pUC19-P35S:ARF8的酶切电泳图谱（栏0：DNA Maker ; 栏2：本实验的酶切图谱）
根据限制性核酸内切酶EcoRI的特性可知，限制性核酸内切酶EcoRI属于第II类限制性内切酶，可以切割某一特异的核苷酸序列，是重组DNA的基础。
本实验中限制性核酸内切酶EcoRI在重组质粒pUC19-P35S:ARF8上有6个识别位点，即可以识别六个核苷酸序列：5’-G？AATTC-3’，完全酶切时可把重组
质粒切割成6个分子量大小不一的DNA片段，分别为：289bp、450bp、612bp、873bp、1363bp、2703bp，因此完全酶切时，我们能够在酶切电泳图谱上看到6条不同的条带。
然而，本次实验的酶切电泳图谱表明，本次实验不成功，操作上存在不足或缺陷，导致限制性核酸内切酶EcoRI对重组质粒pUC19-P35S:ARF8的酶切是不完全的或没有酶切的，经过讨论，认为以下原因可能导致本次实验的失败：1．操作时，加入eppendorf管的限制性核酸内切酶EcoRI离开冰箱的时间过长，活性有所降低；
2．制备限制性核酸内切酶EcoRI时没有加入BSA溶液，以致限制性核酸内切酶EcoRI活性下降或影响其酶切机理，导致DNA酶切反应失败；
3．实验时所加入的限制性核酸内切酶EcoRI的用量不足，导致DNA酶切反应不佳；
3．加样时，加样的体积过多或每加完一个样品后没有更换tip头，可能引起相互污染，影响电泳的结果；
4．加样时，由于操作不佳，实验者把样品槽底部凝胶刺穿或损坏，影响了DNA片段的移动。
参考文献：
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