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尹长城 等 : 基于细胞的噬菌体抗体库筛选技术
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持其天然构象 ,这对治疗性抗体的筛选非常重要 。 1. 2 细胞材料的选择 在细胞筛选的靶点中 ,有些是经过鉴定 ,基因序列 已知的抗原 ,有些是尚未进行抗原鉴定的肿瘤细胞株 , 还有一类是对抗原信息知之甚少的肿瘤组织 。对于少 数序列和结构清楚的靶点 ,可以对纯化的抗原或表达 的重组蛋白进行筛选 ,但因为构象变化的原因 ,以这种 方法获得的抗体识别和结合天然状态抗原的能力差别 很大 [35 ] 。通过细胞转染的方法 ,可将抗原蛋白定位至 细胞表面 ,以完整细胞或细胞膜裂解物为靶材料 ,可以 筛选出特异性抗体 [36 ] 。为提高筛选效率 ,获得高亲和 力抗体 ,也可以用转染的细胞免疫动物 ,然后通过细胞 融合的方法制备单克隆抗体或者通过基因克隆的方法 构建免疫抗体库 [21, 37 ] 。通过细胞转染途径筛选出的抗 体具有更好的临床应用前景 ,非转染的野生型细胞与 靶细胞具有相同的遗传背景 ,因此在对抗体库进行筛 选时 ,可以用野生型细胞进行负选择 , 降低选择的背 景 ,提 高 效 率 。采 用 这 种 策 略 , 已 成 功 地 筛 选 出 了 EGFR [26 ]和 ErbB2[27 ]等肿瘤相关受体的特异性抗体 。 通过细胞转染的方式进行抗体筛选是一种直接 、 有效的方法 ,但并非适用于所有情况 ,由多个亚基构成 的复杂抗原就难以通过转染方式获得 。此外 ,不同类 型细胞间存在蛋白质转运和加工特性的差别 [38, 39 ] ,这 也可能使外源蛋白不能准确定位 。在肿瘤细胞的蛋白 质组学研究中发现 ,可表达于骨髓细胞 NB4 细胞膜表 面的蛋白 ATAD3A ,转染 HEK293T细胞后只能在胞浆 中检出 ,而不能定位至细胞表面 [22 ] 。此外 ,对转染细胞 和原始肿瘤细胞株的筛选效率也不相同 ,以对 EGF ΟR 抗体的筛选为例 ,当分别用高表达 EGFΟR 的肿瘤细胞 系 A431 和转染了 EGF ΟR 基因的 CHO 细胞进行筛选 时 ,对 A431的抗体筛选效率高于转染的 CHO ∷EGFΟR 细胞 ,获得抗体的特异性也好一些 ,这部分归因于 A431 细胞株抗原表达丰度高于转染的细胞 ,但根本原因在 于细胞对靶蛋白的加工 、转运和定位能力的差异 [40 ] 。 1. 3 对复杂抗原和未知抗原的筛选 对于未知抗原类型的肿瘤抗原或复杂抗原 ,采用 肿瘤细胞或组织进行筛选较为有效 [21 ] 。对于已经建株 的肿瘤 ,可以选择细胞系进行筛选 ,不过 ,已建株细胞 经数代培养后 ,细胞表面的抗原表位会与原始肿瘤有 较大差别 [41 ] 。对细胞表面抗原的蛋白质组作图发现 , 传代培养的肺微血管内皮细胞表面约有 40%的抗原表 位丧失 [42 ] 。细胞表面抗原的表达状况与所处的环境 、
2 基于细胞的抗体筛选的典型
2. 1 内化抗体的筛选 通过受体介导的内化可以将抗体携带的药物分子 或毒素经胞吞作用摄入细胞内发挥作用 。抗体经与细 胞表面的受体类抗原互作完成内化 。筛选可内化的噬 菌体抗体首先要求噬菌体抗体能进入胞内 ,以便能将 携带的效应分子带入细胞 ,其次 ,在筛选过程中 ,内化 的噬菌体抗体要能经裂解细胞而回收 ,进入下一轮淘 选 。以免疫毒素为例 ,常用的毒素分子为 PE38,其可与 介导内化的受体结合的结构域已被删除 ,要完成对细 胞的杀伤需要通过与其融合的抗体分子完成识别 、结 合和内化过程 ,这种特异性内化可以降低免疫毒素的 非特异杀伤作用 。单链抗体在体内的清除速度很快 , 其半寿期较短 ,仅有数小时 [48 ] ,并且因为受体介导的内 化过程一般都伴随受体的二聚化 ,因此选择分子量更 高的双价抗体进行内化检测和筛选会更有效 [49 ] ,各种 形 式 的 scFv 二 聚 体 , 如 ( scFv ) 2、D iabody 以 及 M iniantibody等抗体的分子量都接近或超过 60kDa,有 助于延长半寿期 ,同时可以提高内化效率 。内化的噬 菌体颗粒可通过将细胞用三乙胺溶液裂解 ,中和后回 收 ,裂解前用胰蛋白酶溶液可将结合在细胞外基质上 的噬菌体洗脱下来 ,提高富集率 。将细胞从培养器皿 上洗脱并转至新的容器进行后续实验可以降低容器壁 粘附的噬菌体对实验的干扰 。 2. 2 血管上皮抗原的抗体筛选 对于多数抗原都可以用完整的细胞或组织进行筛
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综 述
基于细胞的噬菌体抗体库筛选技术 3
尹长城 1 黄华樑 2 阎锡蕴 133
(1 中国科学院生物物理术有限公司 北京 102206)
收稿日期 : 2008206216 修回日期 : 2008208227 3 国家“863”计划 (2006AA02A245)资助项目 33 通讯作者 ,电子信箱 : yanxy@ sun5. ibp. ac. cn
研究 日 益 广 泛 。针 对 结 肠 癌 [8～12 ] 、乳 腺 癌 [13 ] 、肺 腺 癌 [ 14, 15 ] 、胰腺癌 [ 16 ] 、前列腺癌 [ 16～18 ] 、卵巢癌 [ 19 ] 、黑色素 瘤 [ 20, 21 ] 、急性髓白血病 [ 22～24 ]以及神经胶质瘤 [ 25 ]等多种 肿瘤都有细胞筛选的报道 。此外 ,该技术也用于细胞 表面受体 [26, 27 ]和血管内皮细胞抗原表位 [28, 29 ]抗体的筛 选 ,还可用于抗原鉴定 [ 13, 16, 24, 30, 31 ] 。针对细胞的抗体筛 选包括靶细胞的确定 、构建抗体库以及抗体的筛选和 鉴定几个环节 。 1. 1 细胞表面抗原的特殊性 肿瘤抗原多为蛋白质或糖蛋白 ,种类繁多 ,而且表 达量很低 ,因此难以分离和纯化 。与新生血管生成有 关的血管上皮抗原表位也与肿瘤的发生和转移密切相 关 ,这些肿瘤相关抗原和受体蛋白一样 ,多具有膜蛋白 的结构特征 ,或是可以形成复杂的结构 。常规的固相 筛选中 ,包被的固定化抗原不能保持天然构象 ,因而不 适于对膜抗原或细胞表面的抗原表位进行筛选 。 自上世纪 90 年代以来 ,直接对肿瘤组织 、完整细 胞或细胞 膜 裂 解 物 进 行 抗 体 筛 选 的 研 究 逐 渐 开 展 起 来 。筛选的靶材料可以是经非离子型去污剂处理过的 细胞碎片 [32 ] ,全血细胞 [6, 7 ] , 肿瘤组织切片 [8, 33 ]以及固 定化单层细胞 [19, 34 ] 。在这些材料中 ,抗原分子可以保
摘要 肿瘤细胞表面抗原的表达量低 ,免疫原性弱 ,用固定化抗原方法筛选时 ,因抗原构象改变 而很难获得有价值的抗体 。同时 ,这类抗原多具有复杂的结构 ,其转运 、定位与细胞类型及所处 的微环境有关 。在基于细胞的筛选中 ,靶抗原处于天然状态 ,且不需纯化 ,甚至可以对未知抗原 进行筛选 ,因此广泛用于对内化抗体和血管内皮抗原表位抗体的筛选 。基于细胞筛选的主要问 题是非特异结合导致的选择背景过高 ,为此 ,许多研究都致力于改善选择的灵敏度和特异性 。伴 随高通量流式细胞术 、组合化学及蛋白质组学研究技术的运用 ,细胞筛选技术将更趋实用和成 熟 。拟对细胞和组织的筛选技术作一概括 ,为了解基于细胞的筛选和优化实验设计提供参考 。 关键词 抗体 细胞筛选 噬菌体展示 中图分类号 Q819
自单克隆抗体技术问世以来 ,除目前获批用于临 床治疗的 20余种抗体外 ,更多的抗体广泛用于诊断和 科学研究之中 。特别是过去 20年间 ,随着 PCR 和噬菌 体展示技术的出现 ,抗体分子展示技术也不断发展 ,继 噬菌体展示技术之后 ,核糖体展示 [ 1 ] 、mRNA 展示 [2, 3 ] 等体外展示技术以及细菌展示 [4 ] 、酵母展示 [5 ]等多种 细胞展示技术的应用也日趋广泛 , 。这些展示系统筛 选的靶点依然以固定化抗原为主 。
1 基于细胞的抗体筛选
在对肿瘤抗原和受体等膜蛋白的筛选中 ,保持其 天然构象至关重要 ,因此常规的固相筛选难以胜任 ,而 对表达这些抗原的完整细胞进行筛选可以避免构象改 变引起的问题 ,除完整细胞外 ,细胞膜制备物以及肿瘤 组织切片上的抗原蛋白都可以维持天然构象 ,因此 ,这 些材料也可以作为筛选细胞表面抗原的靶材料 。基于 细胞的抗体筛选最初用于细胞分型 [6, 7 ] ,由于抗体在肿 瘤诊断和治疗中的特殊价值 ,对肿瘤细胞进行筛选的
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Vol. 28 No. 12 2008
混合孵育 ,经低速或差速离心将结合有噬菌体的细胞 分离到有机相回收 。对于标记了的靶细胞 ,还可以同 时加 入 负 选 择 细 胞 来 筛 选 , 经 FACS ( fluorescence Ο activated cell sorting) 或 [7 ] MACS (magnetic activated cell sorting ) [11 ]的方法把标记了的靶细胞分选出来 。借助 已有的单 克隆 或 多 克隆 抗 体 作 为 探 路 分 子 , 可 以 用 Pathfinder方法来筛选结合的抗体 ,也可进行抗原的分 离 [46 ] 。在对噬菌体 Fab 抗体库筛选时 ,可以用传统的 嗜菌斑转移 ( p laque lift assay) 以及改良的捕获转移方 法 ( cap ture lift) [47 ]进行筛选和鉴定 ,这类基于 NC 滤膜 的筛选方法操作简单 ,无需富集过程 ,可一次完成 ,受 平板上克隆密度的限制 ,每个 100mm 平皿的分辨力为 500pfu,要筛选大容量抗体库难度很大 ,也无法控制筛 选过程的严谨性 ,因此更适宜进行经预筛选后的再筛 选 ( subΟscreening) 。
细胞间互作以及细胞与基质的互作都有关系 [43 ] ,尽管 如此 ,这些抗原以天然状态呈现的抗原蛋白 ,仍不失为 一种可靠的靶点 。因为材料来源的限制 ,大多数检测 或手术中获 得 的 病理 组 织 数 量 有 限 , 细 胞 类 型 不 单 一 [20 ] ,虽然不同病人间样本的差别也会给筛选带来不 利影响 ,但是却可以消除个体间差异 ,使结果更具代表 性 [12 ] 。对复杂抗原筛选的过程中 ,通过建立模型可以 对筛选的参数进行优化 ,其中 ,孵育时间是关键 ,孵育 时间越长 ,特异性克隆的富集效果越好 ,对其他参数的 调整也会影响筛选结果 [44 ] 。M utuberria 等建立了两个 模型来研究不同靶材料对筛选结果的影响 ,第一个模 型以肿瘤上皮糖蛋白 Ο2 ( Ep ithelial glycop roteinΟ2; EGPΟ 2)为靶抗原 ,比较了重组蛋白 、完整细胞 、组织切片及 体内筛选等各种形式的筛选效率 ;第二个模型以 E Ο选 择素 ( EΟSelectin)为靶抗原 ,比较了对培养的单层细胞 和固定于柱上的细胞悬液的筛选效果 。将细胞与噬菌 体孵育后再上柱比用单层培养细胞进行筛选的富集效 率高出很多 ,可能是因为培养的细胞所呈现的抗原数 量有限 [11 ] 。对于未知抗原 ,深入了解其组成和结构将 有助于选择恰当的筛选策略 ,提高选择的有效性和特 异性 。 1. 4 抗体库的选择 在对细胞进行的抗体筛选中 ,可以使用由免疫动 物 B细胞中扩增获得的抗体基因制备的免疫抗体 库 [29, 32, 37 ] ,也可用无抗原倾向性的天然抗体库 [15 ] 、合成 库 [45 ]及半合成库 [ 22 ] 。免疫抗体库的制备简单 ,其编码 序列的抗原倾向性强 ,筛选的背景简单 ,因此有望在库 容有限的情况下快速得到高亲和力的抗体 ,不便之处 在于 ,对于每种抗原 ,都需要重新免疫和建库 ,但对于 某些抗原 ,由于免疫耐受或者毒性原因 ,很难奏效 。此 时可以选择大容量非免疫库或者合成库完成筛选 ,特 别是对于未知抗原和免疫原性很低的自身抗原 ,提高 库容以增加成功筛选的机会至关重要 。天然库和全合 成大容量抗体库序列构成无倾向性 ,容量大 ,且能克服 体内抗体重组过程中对自身抗体的抑制 ,因此适用性 更广 。半合成抗体库中抗体分子的一条链 (一般为轻 链 )序列固定 ,仅在重链中引入多样性 ,因此所构建的 抗体库可能具有抗原倾向性 [ 20 ] 。 1. 5 细胞分选的方法 对于在细胞培养板上生长的贴壁细胞 ,噬菌体抗 体库的结合 、洗涤和洗脱与常规的固相筛选相似 。对 于悬浮细胞的分选 ,则可以将噬菌体与待筛选的细胞