5.2 噬菌体抗体库技术
• 噬菌体展示技术 （phage display technology）的应用
5.2.1 噬菌体展示技术
• 将肽段的基因克隆到丝状噬菌体的基因组DNA中 • 与噬菌体的外壳蛋白形成融合蛋白 • 呈现于噬菌体表面
特点：将特定分子的基因型和表型 统一在同一病毒颗粒内
5.2.1.1丝状噬菌体
5 抗体库技术
• 通过DNA重组技术克隆全套抗体可变区基 因,并在原核系统表达有功在蛋白质组学研究中的应用
-细胞与分子免疫学杂志(Chin J Cell Mol Immunol)2003, 19(2):105-106
• 抗体库技术的主导思想，是
• 重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR) 由于采用具有互补末端的引物,使PCR产物 形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通 过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重 叠拼接起来.
• 优越性：
简便易行 筛选能力强 可直接得到特异克隆编码DNA
5.2.2 噬菌体抗体库
• 将多样性可变基因组装到表达载体内，表 达到噬菌体表面得到多样性噬菌体抗体的 集合，即噬菌体抗体库（phage antibody library） • 通过吸附-洗脱-扩增的富集过程，可有效地 从噬菌体抗体库中筛选到特异性抗体的可 变区基因
• 感染大肠杆菌，噬菌体形成噬菌斑 • 相应噬菌体载体上的κ链基因和Fd段基因得 到表达，形成有功能的Fab段，释放于噬菌 斑内
• 将噬菌斑转印到硝酸纤维素膜上 • 用标记的抗原筛选产生特异性抗体的克隆， 得到其Fab段的基因， • 建立了完整的抗体库技术
较细胞融合杂交瘤技术的优越性：
• 1. 省去了细胞融合的步骤 • 2. 扩大了容量， 106 以上个克隆 • 3. 直接得到抗体的基因，不丢失，便于进 一步构建抗体 • 4. 利用原核表达系统的优势 • 5.可制备难于制备的抗体
• M13 • fd • f1
• 复制型DNA被用来做基因克隆的载体 • 基因组为单链环状DNA • 基因中有一段基因间隔区（intragenic region）,含有病毒合成的起始和终止信号， 以及子代噬菌体生成组装的信号
• 基因组共编码10种蛋白质，包括结构蛋白 和DNA 合成和子代噬菌体的包装释放所需 蛋白 • 管状蛋白外壳，蛋白Ⅷ（2 700-3 000个）， 蛋白质Ⅲ 和Ⅵ，蛋白质Ⅶ和Ⅸ
5.1 初期的抗体库
• 5.1.1 背景 • 5.1.2 初期的抗体库
5.1.1 背景
• DNA重组技术的发展和抗体基因结构的阐 明，促进了80年代初基因工程抗体的发展
• 基因工程抗体，极大地改善了抗体的性能 和扩展了抗体的应用范围
• 抗体库技术，通过DNA重组技术，克隆全 套抗体可变区基因，在原核系统表达有功 能的抗体分子片段（即抗体库），从中筛 选特异性抗体的基因。
抗体库技术包括的主要过程：
• • • • 克隆出抗体全套可变区基因 与有关载体连接 导入受体菌系统 利用受体菌蛋白合成分泌等条件，将这些 基因表达在细菌、噬菌体等表面 • 进行筛选与扩增，建立抗体库
本章内容
• 5.1 • 5.2 • 5.3 • 5.4 初期的抗体库 噬菌体抗体库技术 大容量抗体库 抗体库技术的应用
• 两项关键技术： • PCR：用一组引物，扩增出全套免疫球蛋 白的可变区基因 • 以大肠杆菌(或噬菌体)直接表达有功能活性 的抗体分子片段
• 噬菌体展示技术（phage display）应用到 抗体的表达与克隆
5.1.2 初期的抗体库
• Ward 等:
溶菌酶免疫小鼠 脾细胞DNA PCR扩增出VH基因 大肠杆菌表达出VH段 21 /2，000个克隆 与溶酶体特异性结合的克隆
将某种动物的所有抗体可变区基因克隆在 质粒或噬菌体中表达 利用不同的抗原筛选出携带特异抗体基因的 克隆，从而获得相应的特异性抗体
• 基因工程抗体技术，是继杂交瘤单克隆抗 体技术以后抗体领域的又一次革命
• "噬菌体抗体库技术"又被誉为这次革命中 的革命
• 该技术的最大优势在于可以使人们绕过杂
5体抗体表达的分子片段 • 表达 Fab时，将轻链基因和Fd基因组合在 同一个表达载体内，或不同载体导入同一 个大肠杆菌细胞内，一个基因与外壳蛋白 形成的融合蛋白链固定在细胞内膜上，另 一链分泌到质周腔，二者可形成有活性的 抗体
• 表达ScFv时，通过重叠延伸拼接法 （replicing overlap extension, ROE）用 PCR直接将轻链和重链可变区基因组合在 一起；构建ScFv时用可变区3’端做引物， 不受重链同种型的限制，有更好的多样性。
噬菌体对大肠杆菌的感染：
• 1.通过蛋白质Ⅲ对细菌表面性菌毛的识别感 染细菌 • 2.感染后其基因组DNA 进入细菌 • 3.DNA 转变为双链DNA • 4.在噬菌体蛋白的作用下，复制大量单链 DNA • 5.与细胞膜上的噬菌体外壳蛋白组装成完整 噬菌体。
用于噬菌体展示的基因Ⅷ和Ⅲ蛋白
• 蛋白Ⅷ：50个氨基酸，中央一段疏水，可 先镶嵌在细菌内膜上；可多价表达。 • 当外源蛋白的基因与基因Ⅷ融合，就会在 噬菌体表面表达
1989年 Huse 等， 在Science上发表了完整 的抗体库工作： • 用逆转录-PCR技术从淋巴细胞克隆出抗体 轻链基因库（repertoire）和重链Fd段基因 库
• Repertoire 所有的节目
• 将轻链和重链基因分别组建到噬菌体表达 载体中，得到轻链基因库和重链Fd段基因 库 • 通过DNA重组技术将轻链基因和Fd段基因 随机配对重组于一个表达载体中，形成组 合抗体（基因）库 • P109
• 蛋白Ⅲ：406个氨基酸，在感染的细菌内， 羧基端固定在内膜上，氨基端朝向质周腔 每个噬菌体有3-5个副本，氨基端与大肠杆 菌的性毛结合，介导感染；羧基端与子代 噬菌体的释放有关 可低价表达外源蛋白，有利于高亲和性配 体的筛选
5.2.1.2 噬菌体展示技术的选择功能
• 筛选过程：
Propagation 增殖