退火：50-60℃
PCR仪
延伸：72℃ 循环数：20-30次
PCR仪
混合液
2-3 小时
电泳
凝胶成像系统
最终产物 紫外光观察
我不大喜欢动手,我宁肯不动手,我 不喜欢做费力的事。作为一个发明 家,重要的一点是为解决某些问题而 尽力设计一个简捷的动手方案 Kary B. Mullis (1944 -) /
生化与分子生物学实验（二）
实验三 基因序列查找及PCR引物设计
长江师范学院生命科学系
陈发波
一、实验目的
1、掌握PCR扩增原理； 2、学会在NCBI网站上查找相关生物信息；
3、学会利用Primer5软件设计引物
二、聚合酶链式反应（PCR）
聚 合 酶 链 式 反 应 （ Polymerase
Chain Reaction，PCR）:
Mg2+, Tris缓冲液溶液等
PCR反应步骤
பைடு நூலகம் DNA解链（变性）
引物与模板 DNA 相结合（退火） DNA合成（延伸）
重复以上三个步骤
经多次循环之后，反应混合物 中所含有的双链 DNA 分子数，即 两条引物结合位点之间的 DNA 区 段的拷贝数，理论上的最高值应是 2n 。
反应仪器
变性：94℃
三、基因序列查询
BCBI（美国国立生物信息中心） 主页： / Mapview： /mapview/ind ex.html
四、引物设计
引物设计有3条基本原则：
1、引物与模板的序列要紧密互补
2、引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹 结构
3、引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反 应(即错配)
引物设计考虑的主要因素 1、引物长度：一般18-24个碱基对 2、相似性较高序列
3、引物二聚体或发夹结构
4、引物序列的GC含量：一般为40-60%
五、作业 1、在NCBI上查找一段基因序列，将碱基序列
是利用DNA片段旁侧两个短的 单 链 引 物 ， 在 体外快 速扩增特 异 DNA片段的技术。
PCR基本原理
反应材料
模板DNA
引物对
按照与扩增区段两端序列彼此互补的原则设计；
DNA聚合酶：耐高温
Taq DNA polymerase、Pfu DNA polymerase
dNTP 缓冲液溶液
抄在实验报告上，标明基因名称、基因编号。
2、利用Primer5 软件设计一对与你查询基因 序列相应的PCR扩增引物。