《卷烟主流烟气中主要杂环胺类化合物（AαC, MeAαC, Trp-p-1和Trp-p-2）的测定液相色谱－串联质谱法》标准项目实验报告中国烟草总公司郑州烟草研究院2011.8目录一、前言 (1)1 概述 (1)2 卷烟主流烟气中杂环胺的前处理方法 (3)3 卷烟主流烟气中杂环胺的分析测定方法 (3)3.1 气相色谱和气质联用法 (3)3.2 液相色谱和液质联用法 (4)3.3 毛细管区域电泳 (5)3.4 酶联接免疫吸附剂测定法 (5)3.5 小结 (6)二、卷烟主流烟气中主要杂环胺类的分析 (6)1 仪器与试剂 (6)2 卷烟主流烟气中主要杂环胺类化合物的收集和前处理 (7)3 液相色谱和质谱条件 (8)4 标准曲线的配制 (9)5 主流烟气中主要杂环胺的定性和定量测定 (10)三、讨论 (11)1 超声萃取溶剂选择 (11)2 不同萃取方式的影响 (11)3 不同超声萃取时间的影响 (12)4 固相萃取过程中待测目标物的保留情况 (12)5 待测目标物洗脱体积的确定 (13)6 流动相pH值的影响 (14)7 前处理后样品的稳定性 (15)8 不同类型吸烟机的影响 (15)9 标准曲线方程和检测限 (16)10 精密度和回收率 (16)11 杂环胺比对实验结果 (17)12 卷烟样品的测定结果与文献报道结果的比较 (17)参考文献 (19)一、前言1.概述杂环胺类化合物是卷烟烟气中非常重要的两类有害成分，主要是在卷烟抽吸过程中由含氮化合物和含氧化合物燃烧、裂解而产生的，在主流烟气中的释放量较低，基本在纳克级的水平，但生物活性非常强，这些物质具有致癌或致突变作用，对人体健康具有较强的危害性。
HOFFMANN在2001年公布的69种有害成分清单中，就包括8种杂环胺类化合物。
近年来，社会各界对吸烟与健康的问题日益关注，随着我国政府签署了烟草框架公约（FCTC），对烟草中有害成分信息披露的要求也越来越高。
因此为了更好地评价卷烟烟气的危害性，目前很有必要对以上杂环胺类化合物进行比较详细的研究，特别是在分析方法上，需要发展准确有效的分析技术对其进行定量的描述，这样才能科学评价其对卷烟危害性的影响，研究这些有害成分的形成机理，为开发烟气有害成分降低技术提供可靠的数据支撑。
杂环胺是由蛋白质、氨基酸热解产生的一类化合物，多种煎炸食品[1-6]、咖啡饮料[7]、卷烟烟气[8-13]、江河水[14]以及尿样[6,15,16]中都可以检测到这类化合物的存在。
杂环胺具有强烈的致癌性和致突变性，可引起哺乳动物的基因突变、染色体畸变及姐妹染色体变换等，其中一些杂环胺类化合物的致突变活性很强，一些还被证明可以引起实验动物多种组织的肿瘤。
这类化合物在环境和日常食品中普遍存在，它们造成的健康危害已成为食品安全领域关注的热点问题之一。
1939年，瑞典科学家Widmark用烤马肉提取物反复涂抹于小鼠背部皮肤，发现可以诱发小鼠乳腺肿瘤[17]，但这一重要结果在当时并未引起人们的重视。
多年后，Sugimura[18]发现鱼和肉类食品经烹调后可形成具致突变性的物质，同年Nagao发现烤鱼及肉的烟气中具有致癌物质[19,20]，激发了人们对氨基酸、蛋白质热解产物的研究兴趣，从而导致了新的致癌、致突变物的发现，并将这一类物质归为杂环胺类物质。
目前大量研究已证明，大部分杂环胺类物质具有致癌、致突变性，它可以导致小白鼠的肝癌、大小肠癌、口腔癌、胰腺癌以及乳腺癌等等。
杂环胺进入人体后，主要是在P450细胞色素氧化酶的作用下，发生N-氧化和O-乙酰化反应生成DNA加合物后产生致突变和致癌作用[21-27]。
迄今为止，已从烹调的食品分离鉴定的具有有的致突变和/或致癌杂环胺物质已超过20种。
对于烟气中的杂环胺的研究起始于1962 Poindexter and Carpenter报道了卷烟烟气中含有哈尔满与降哈尔满（β-咔啉）[8]。
上个世纪八十年代初，Yoshida 与Matsumoto[28]对烟气中杂环胺的分析检测，检测的杂环胺有AaC与MeAaC，他们分别用HPLC-荧光检测器定量分析了烤牛肉与卷烟主流烟气中AaC与MeAaC，发现对于这两种杂环胺，9g烤牛肉的杂环胺含量与23支卷烟主流烟气中的含量相类似。
1998年D Hoffmann与I Hoffmann发表了一份无滤嘴香烟主流烟气中具生物活性的物质的名单，其中包括Trp-P-1、Trp-p-2等八种杂环胺类化合物[29]。
表1和图1为烟气中可能存在的八种杂环胺类化合物名称、致癌等级以及结构图。
表1 卷烟烟气中的主要杂环胺类化合物化合物名称缩写CAS号致癌性2-氨基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚AαC26148-68-5 2B 2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并[2,3-b] 吲哚MeAαC68006-83-7 2B 2-氨基-3-甲基咪唑并[4,5-f]喹啉IQ 76180-96-6 2A 2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并4,5-b]吡啶PHIP 105650-23-5 2B2-氨基-6-甲基-二吡啶并[1,2-a:3’,2’-d] 咪唑Glu-P-1 67730-11-4 2B 2-氨基二吡啶并[1,2-a:3’,2’-d] 并咪唑Glu-P-2 67730-10-3 2B 3-氨基- 1,4-二甲基-5H-吡啶并[4,3-b]吲哚Trp-P-1 62450-06-0 2B3-氨基-1-甲基-5H-吡啶并[4,3-b]吲哚Trp-P-2 72254-58-1 2B图1 卷烟烟气中的主要杂环胺类化合物的结构图2.卷烟主流烟气中杂环胺的前处理方法由于烟气样品的复杂性、样品中杂环胺含量较低（大多为ng级别）并且存在大量的基质影响，导致了实际的样品分析中提取过杂环胺以后，要进一步进行分离纯化来排除样品中其它物质的干扰。
杂环胺属于有机碱，通常都是用有机溶剂或酸性水溶液来提取，再用CH2Cl2 [10,30-31]、乙酸乙酯[30,32,33]等进行液液萃取除去酸性或中性杂质，此外，除有机溶剂或酸性水溶液外，卷烟烟气还常用玻璃纤维进行捕集[28,34,35],再用有机溶剂进行洗涤。
Kataoka H等[11]采用液液萃取法提取了卷烟主侧流烟气中的杂环胺，作者先用人造纤维富集烟气中的杂环胺，再用甲醇/氨（50：1）洗涤，调节洗涤液的pH值后，用CH2Cl2重新萃取，最后作者在卷烟主侧流烟气中检测到了AaC、Trp-P-1、IQ和PHIP。
Sasaki T A等[10]采用液液萃取法提取了卷烟主流烟气中的杂环胺，作者先用0.1M的盐酸萃取剑桥滤片，调节pH值后，再用CH2Cl2萃取，检测到IQ和PHIP。
Yukari Totsuka等人[13]用有机溶剂萃取卷烟烟气滤片后，再用蓝棉提取杂环胺，以甲醇/氨洗脱，定量分析了哈尔满与降哈尔满。
液液萃取方法是常用的分离方法，其优点是操作简单、方便，但费时、费力，因该方法需要大量不混溶的溶剂，有些是有毒、易挥发、易燃的，在样品预处理方面存在局限性，所以需要寻找更好的样品预处理方法。
近年来，固相萃取法得到了日益广泛的应用。
因为它具有样品处理迅速，操作简单、方便，避免乳化现象，易于自动化操作等优点。
1996年，Gross G A等[36,37]提出了固相萃取的方式来分离纯化复杂样品中的杂环胺。
该方法既可以提高萃取率，又可以节省时间和费用，减少样品的用量，同时提取复杂样品中的多种杂环胺。
经过近年来不断修改，几乎成为杂环胺分析测定的标准前处理方法，用来测定的样品也覆盖了许多含有杂环胺类化合物的样品，3.卷烟主流烟气中杂环胺的分析测定方法鉴定复杂样品中杂环胺的方法很多，液相色谱、液质联用、气相色谱、气质联用，毛细管区域电泳仪和酶联免疫吸附剂测定等方法都已经被用来定性定量分析复杂样品中的杂环胺。
3.1 气相色谱和气质联用法气相色谱由于其简单、灵敏度高以及耗费低的优点已经被广泛的应用在杂环胺的分析测定中，但是由于大多数的杂环胺是低挥发性，并且具有一定的极性，在气相分析时对气相色谱柱和进样口有很强的吸附性，色谱峰会趋向于出现宽峰或拖尾峰，因此杂环胺在进行气相色谱分析之前要先进行衍生化。
杂环胺的衍生化不仅可以减少杂环胺的极性，而且可以提高杂环胺的挥发性、灵敏度、选择性以及分离度。
三氟甲基苯甲酰[38]、五氟丙酸酐、七氟丁酸酐、N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛等很多衍生化试剂都可以用来衍生化杂环胺[37,39-45]。
因为衍生物中含有N原子，氮磷检测器常用来检测杂环胺的衍生物。
Kataoka[46]等建立了一种简单快速的衍生方法，作者采用DMF-DMA衍生、GC-NPD测定了10种具有致突变性的杂环胺。
该研究组[11]还采用盐酸/抗坏血酸对捕集卷烟主、侧流烟气后，用蓝棉处理，再用DMF-DMA对杂环胺衍生，以GC/NPD分析，检测到卷烟烟气中杂环胺AaC 、Trp-p-1、IQ、PHIP和MeIQ。
气质联用结合了气相色谱简单耗费低的优点以及质谱高灵敏度和高选择性的优点。
其中，和EI相比，负化学电离(NCI)对于含氮的化合物的选择性更好、灵敏度更高，比较适合复杂样品中痕量杂环胺的鉴定[47-49]，和气相色谱方法相同，杂环胺类化合物在色谱分析之前通常要先进行衍生化过程。
但Christopher [47]等未对杂环胺化合物进行衍生，直接进GC/MS分析。
作者用滤片捕集主流烟气粒相物，用HCl超声萃取后过MCX固相萃取柱净化样品，洗脱液蒸干后用乙腈溶解后进GC/MS分析。
采用外标法对哈尔满、降哈尔满、AaC和MeAaC定量分析。
哈尔满与降哈尔满的检测限分别是33.1 和84.7 ng/支，AaC 和MeAaC的检测限为3.1和1.4 ng/支。
两个加标水平30 and 750 ng/支的回收率都在79.9和102%之间。
Sasaki T A等[10]用滤片捕集主流烟气粒相物，用HCl萃取后调节pH值，再用CH2Cl2重新萃取，之后用七氟丁酐(HFBA )和N,N-二甲基甲酰胺对杂环胺进行两步衍生，用NCI- GC-MS（选择离子监测）分析。
用此种方法检测了烟气中PHIP和IQ，浓度水平0.5 ng/支，方法的检测限为0.1～0.5 ng/支。
3.2 液相色谱和液质联用法HPLC是一种普遍有效的分析杂环胺的方法，每一种杂环胺都有特征的紫外光谱和较高的消光系数，并且它们都是电化学可氧化的，因此这些化合物可以通过紫外、电化学和荧光法来检测。
在高效液相方法中，紫外吸收检测是最普遍的方法，大多数的杂环胺在260-275nm内都可以被检测。
但是样品的复杂性使得该方法的选择性不高。
Gross等[50]采用窄孔色谱柱Vydac 201HS52(25cm×2.1mm I.D)检测了肉类制品中的12种杂环胺和哈尔满，使用该柱子的灵敏度比常规柱子（直径4.6mm）要高三倍，该方法已经被很多研究者采纳。