双黄连口服液的质量分析
一、实验目的
1.掌握对照品对照法和对照药材对照法鉴别复方制剂中药材的方法。

2.掌握双黄连口服液中金银花、黄芩和连翘的质量检验方法。

二、仪器与试药
1.仪器
美国PE-60型高效液相色谱仪KQ-300E型超声波清洗器
Mettler AL204电子天平ZF-2型三用紫外仪HHS型电热恒温干燥箱
容量瓶规格：25mL 移液管规格：25mL 滤纸规格：直径10cm
研钵硅胶G薄层板聚酰胺薄膜(5cm×7cm)
2..试药
双黄连口服液规格：每支装10mL
黄芩苷、绿原酸对照品连翘对照药材乙醇二氯甲烷甲醇硫酸醋酸
三、实验原理
采用对照品对照法和对照药材对照法分别鉴别双黄连口服液中的金银花、黄芩和连翘三味主药。

四、实验内容
【处方】金银花375g 黄芩375g 连翘750g
【制法】以上三味，黄芩切片，加水煎煮三次，第一次2小时，第二、三次各1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩并在80℃时加入2mol/L盐酸溶液适量调节PH值至1.0～2.0，保温1小时，静置12小时，滤过，沉淀加6～8倍量水，用40%氢氧化钠溶液调节PH值至7.0，再加等量乙醇，搅拌使溶解，滤过，滤液用2mol/L盐酸溶液调节PH值至2.0，60℃保温30分钟，静置12小时，滤过，沉淀用乙醇洗至PH值7.0，挥尽乙醇备用；金银花、连翘加水温浸半小时后，煎煮二次，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对蜜度为1.20～1.25(70～80℃测)，冷至40℃时缓缓加入乙醇，使含醇量达75%，充分搅拌，静置12小时，滤取上清液，残渣加75%乙醇适量，搅匀，静置12小时，滤过，合并乙醇液，回收乙醇至无醇味，加入黄芩提取物，并加水适量，以40%氢氧化钠溶液调节PH值至7.0，搅匀，冷藏（4～8℃）72小时，滤过，滤液加入蔗糖300g，搅拌使溶解，再加入香精适量并调节PH值至7.0，加水制成1000mL，搅匀，静置12小时，滤过，灌装，灭菌，即得。

【性状】本品为棕红色的澄清液体；味甜，微苦。

【鉴别】(1) 取本品1mL,加75%乙醇溶液5mL，摇匀，作为供试品溶液。

另取黄芩苷、绿原酸对照品，分别加75％乙醇制成每1mL含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。

照薄层色谱法(中国药典2010年版附录Ⅵ B)试验，吸取上述三种溶液各1～2μL，分别点于同一聚酰胺薄膜
(5cm×7cm)上,以醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。

供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

(2) 取本品1mL，加甲醇5mL，振摇使溶解，静置，取上清液，作为供试品溶液。

另取连翘对照药材0.5g，加甲醇10mL，置水浴上加热回流20分钟，滤过，滤液作为对照药材溶液。

照薄层色谱法（中国药典2010年版附录Ⅵ B）试验，吸取上述两种溶液各5μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-甲醇（5:1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热数分钟。

供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

【检查】pH值应为5.0～7.0(附录Ⅶ G)。

相对密度 应不低于1.12（附录Ⅶ A)。

其他 应符合合剂项下有关的各项规定(中国药典2010年版附录Ⅰ J)。

【含量测定】 照高效液相色谱法（中国药典2010年版附录Ⅵ D）测定。

高效液相色谱法的应用范围很广，适于分析沸点高、受热不稳定、不同极性的有机化合物、生物活性物质和多种天然物质。

1.分离原理
被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱，根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。

2.系统适用性试验
色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度和拖尾因子等指标。

按各品种项下要求对色谱系统进行适用性试验，如达不到要求，可对色谱分离条件作适当的调整。

(1) 色谱柱的理论板数(n) 在规定的色谱条件下，注入供试品溶液，记录色谱图，按下式计算色谱柱的理论板数。

t R :供试品主成分峰或内标物质峰的保留时间
W h/2：1/2峰高处的峰宽
（2）分离度(R) 无论是定性鉴别还是定量分析，均要求待测峰与其他峰、内标峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。

分离度的计算公式为：
21)
(212W W t t R R R +-= R ≥1.5
2R t ：相邻两峰中后一峰的保留时间； 1R t ：相邻两峰中前一峰的保留时间
W 1及W 2：此相邻两峰的峰宽
（3）拖尾因子(f s ) 为保证分离效果和测量精密度，应检查待测峰的拖尾因子是否符合各品种项下的规定。

拖尾因子计算公式为：
A W f h s 2/05.0=
W 0.05h ：5%峰高处的峰宽； A ：峰极大至峰前沿之间的距离
3.实验条件与方法
色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水-冰醋酸（50:50:1）为流动相；检测波长为274nm 。

理论板数按黄芩苷峰计算应不低于1500。

对照品溶液的制备 精密称取黄芩苷对照品10mg ，置100mL 量瓶中，加50%甲醇适量，置水浴中振摇使溶解，放置至室温，稀释至刻度，摇匀，即得（每1mL 中含黄芩苷0.1mg ）。

供试品溶液的制备 精密量取装量项下的本品1mL ，置50mL 量瓶中,加50%甲醇适量,超声处理20分钟，放置至室温，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品每支含黄芩按黄芩苷(C 21H 18O 11)计，不得少于80mg 。

五、注意事项
1.进样前色谱仪一定要用流动相平衡，方可进样。

2.进样时进样器一定要清洗干净。

3.进样完毕后，一定先用20％甲醇水溶液冲洗色谱柱，再用100％甲醇平衡色谱柱方可关机。

4.制样时，一定要用微孔滤膜过滤。

22
/)(54.5h R W t n =
六、思考题
1.采用对照品对照法和对照药材对照法鉴别双黄连口服液中金银花、黄芩和连翘时的影响因素有哪些？
2. 在HPLC测定样品含量时，实验操作中应注意哪些问题？
3.色谱系统适应性检验的目的与指标是什么？
七、参考文献
《中国药典》2010年版一部，405，化学工业出版社。

附：美国PE-60高效液相色谱仪操作程序：
开机：1.闭合电源开关，使电压稳定在220V。

2.启动A、B、C三泵，启动SPD-6A检测器，待检测器稳定后（屏幕显示数值为0），打开柱温箱（CTO-6A）开关：开启系统控制器（SCL-6B，仅当检测器稳定后系统控制器可以工作）；系统控制器联动进样器（SIL-6B，分自动进样与手动进样）。

3.用系统控制器设置A、B、C三泵的流动相（流量）、柱压（最大与最小）、柱温（最高与最低）、检测波长。

4.启动计算机控制，屏幕显示SET SYSTEM DISK OK，运行程序（仅当有该系统软件时），屏幕显示Press[SET] first to set DATE and TIME，掀SET键，显示菜单，选指令2，掀回车键，掀1（表示打开1通道），计算机叫一声，此时，整个色谱分析系统联通，打开流动相阀，排除运行体系中的空气（空气未排完就进样的话，系统会自动停止工作）。

测定：按各品种项下的要求进样。

关机：键入CLOSE TRS 1，计算机叫一声，可以关机，按以下顺序：关闭系统控制器，关闭柱温箱，关闭检测器，调节A、B、C三泵的压力至0，关闭A、B、C三泵。