SPD(二极管阵列检测器)与ELSD 同时检测, 发现双氢青 蒿素转化平衡后SPD图中。a异构体与β异构体峰面积之 比为4: 1 , 而ELSD 检测得。a异构体与β异构体峰面积之 比为8 : 1。因为E L SD 对结构相似物质能给出几乎一致 的响应因子, 属于质量响应型检测器, 因此得到的峰面积比 即为转化平衡后a异构体与β异构体的实际物质量比。从 而也可得知a与β异构体对U V 的响应因子不同, 如用UV 检测则不能直接采用二者峰面积之和定量。
2.末端吸收[14]
色谱条件：
色谱柱Kromasil
ODSC18(416mm ×250mm, 5 μm); 流动相为乙腈-水 ( 60：40); 流速为 1.0mL/min; 检测 波长为203nm; 柱 温30℃。理论塔 板数2000.
1.2.4 LC-MS-MS
体内药物分析是测定体液(主要是血浆、血清或全血)中药物或其他代 谢物浓度。由于血液样品试样提供量少，基质复杂，在此混合物中分 析某种微量成分(通常为(g/mL或ng/mL水平)并加以鉴别，常常是对分 析化学家的挑战。
色谱分析条件 色谱柱: Nucleodur C18 ( 250mm ×416 mm, 5μm D) ; 流动相: 乙腈-0.1%乙酸 (50 ∶50) ; 流速: 110 mL/min ; 柱温: 25 ℃青蒿乙 素和青蒿酸用UV检测器检测, 波长为209nm; 青蒿 素用ELSD检测器检测, 漂移管温度50 ℃, 载气 (N2 )压力30 p si ( 1 p si≈ 619 kPa) , 增益值为50; 进样体积为10或30μL。
LC-MS虽然有足够的灵敏度，但遇到LC难以分离的组分，其应用受到 限制。使用LC-MS／MS可以克服背景干扰，通过MS／MS的选择反 应控制模式(SRM)或多反应检测模式(SRM)，提高信噪比，因此对复 杂样品仍可达到很高的灵敏度。
药物的是用来预防、诊断及治疗疾病的一类特殊物质，与人们的健康 和生命安危有极其密切的关系，杂质检查及其限度控制是保证药品质 量的一个重要方面。使用LC-MS／MS可以简便地对药物中杂质加以 监控.
青篙素经钠硼氢还原而产 生的半缩醛化合物, 其12 位的羟基具有差向异构, 差向异构体a 与β 在一定 溶剂中有相互转化并达到 平衡的过程。DHA 分子 结构中无共扼结构和发色 基团, 不宜用分光光度法 或HPLC法测定含量。
双氢青蒿素 dihydroartemisinin
定性分析
TLC
紫外分光光度法
例：复方双氢青篙素片（含双氢青篙素32 m g , 磷酸呱哇 0.32g , 甲氧苄啶90 m g )中青蒿素含量的测定
1.对照品溶液:精密称取D H A 对照品适量, 置50 m L 量瓶 中, 加乙睛适量,40 ℃ 超声处理5 min。放冷至室温, 定容, 即得1.28 m g/m L的对照品储备液。再精密量取此储备液 适量, 用水稀释制成256 mg/m L的对照品溶液。
1.2紫外分光光度法
原理：
1.由于青蒿素药物分子结构中母核不具有共轭体系，其紫 外吸收光谱的主要是末端吸收。但C-10位由于取代基不同 具有一定的吸收特征。
2.青蒿素由于具有过氧桥和缩醛结构, 对酸碱不稳定, 对 强碱极不稳定, 热至熔点以上即迅速分解。采用0.2%氢氧 化钠50℃水浴加热30min 进行水解, 水解后的波长扫描结 果显示青蒿素在紫外区有最大吸收峰Kmax=290.5nm, 由 此确定最适波长为292nm。（青蒿素衍生化，酸化后亦可作 HPLC-UV检测）
青蒿素分析方法的确定
主讲人：丁晨
青蒿
青篙为菊科一年生草本植物黄 花篙干燥地上部分，性寒，味苦、 辛，归肝胆经，可清热解暑、除 蒸、截疟，主要分布于重庆、四 川、云南、广西等地。目前青篙 素系列药物已取代奎宁成为治疗 疟疾的最安全有效的药物。青蒿 素是青蒿抗疟的有效成分，也是 合成青蒿素系列药物的起始原料， 它的需求量很大。
4.样液的制备 取青蒿待测样品研细粉末0.5g, 加入95%乙醇10ml 浸泡, 50℃水浴 加热60min 进行提取, 取出样品振摇、冷却、过滤, 取滤液1ml, 加入 95%乙醇14ml, 再加入0.2% NaOH 10ml, 配制成青蒿素样品溶 液,50℃水浴加热30min。在已经确立的最适波长下分别测吸光度,对 浓度作图, 建立标准曲线。
1.3.2 HPLC-UV-ELSD
同时测定青蒿中青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸的方法
青蒿素只有很弱的末端紫外吸收,一般不用UV法进行精确 定量分析,故选择用ELSD法检测。用ELSD法也可检测青蒿 乙素和青蒿酸,但由于其灵敏度低,对这两个成分含量低的青 蒿药材来说,该法同时测定3种成分较困难,故采用灵敏度较 高的UV法对青蒿乙素和青蒿酸进行定量测定。UV检测器 对所测成分性质无任何影响, 据此可使用HPLC-UV-ELSD 同时测定青蒿中3种成分。
2.对照品溶液:取复方双氢青篙素片10 片, 剥去薄膜衣, 精 密称定, 研细, 精密称取适量, 置25 m L量瓶中, 加乙睛适量, 40 ℃ 超声处理5 min。放冷至室温, 定容。摇匀, 滤过, 取 续滤液2 mL 加水稀释至10 mL。
ELSD检测器检测时少量溶解的甲氧苄啶峰及a异构体峰与β异构体峰 均能达到完全分离, 三者的分离度分别为2、8 和4, a异构体与β异构 体保留时间分别约为5 . 7 m in和7 m in , 理论板数按a异构体或β异 构体峰计均不低于6000。SPD扫描图谱显示最先流出的成分为甲氧 苄啶, 与后面的a异构体及β异构体完全分离, 不影响测定。
在选定的检测条件下,DHA 和内标ART 生成的基峰离子 为其加NH4+ 离子[M +NH3 ] + ,将其基峰离子作为母离子进 行产物离子扫描分析,得到二者的全扫描及子离子扫描图。
2.又∵青蒿素在203 直接测定, 大多采用甲醇作溶剂稀释对照品, 使其 在紫外区203 nm处有极弱的吸收, 其灵敏度及重复性均较 差,(选用丙酮作溶剂, 在203nm 处有较强的吸收[11])。
1.衍生化法[13]：
色谱条件：色谱柱: LichrospherC18 ( 4. 6mm×250mm, 5 Lm) ; 流动 相: 甲醇-缓冲液(体积比50：50; 0. 01mo l/LNa2HPO4-NaH2PO4缓冲 液) ; 流速: 0. 8mL /m in; 柱温: 30 e ; 灵敏度: 2. 000 AUFS; 检测波长: 260 nm; 进样量: 20μL。
为什么要测定青蒿素的含量
不同产地的青蒿药材中青篙素的含量差异较大，而青蒿 素是青篙截疟的主要有效成分，因此对药材中青篙素含 量的准确测定十分必要。
提取青蒿素的溶剂：
青蒿素C15H22O5 在丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷或苯中易 溶, 在甲醇、乙醇、稀乙醇、乙醚及石油醚中溶解, 在水中 几乎不溶解; 在冰醋酸中易溶。
1.青蒿素标准品0.1g+95%稀释成0.001%的标准品溶液
2.0.001%标准溶液0.5 ml加入95% 乙醇4.5ml, 再加入 0.2% NaOH 20ml定容至25ml, 50℃水浴加热30min, 取 出快速冷却。
3.分别取0.5、1.0、2.0ml 的.001%青蒿素标准溶液, 分别加入95% 乙醇4.5、4.0、3.0ml, 再各加入0.2% NaOH 20ml定容至25ml, 配成 浓度分别为2×10- 5%、4×10- 5%、8×10- 5%的标准溶液, 50℃ 水浴加热30min, 取出快速冷却, 在已经确立的最适波长下分别测吸 光度。
HPLC chromatograms of reference (A, B) and the extract from Herba Artemisiae Annuae (C, D).A, C: UV； B, D: ELSD; 1: Arteannuin B; 2:
Artemisinin; 3: Artemisinic acid
1.3 HPLC法
原理：利用流动相与组分间的亲和力，通过组分、流动相 和固定相三者间的相互作用来实现分离。
常见检测器: 1. UV 2. DAD（二极管阵列检测器） 3. FD（荧光检测器） 4. RID(示差折光率检测器) 5. ECD(电化学检测器) 6. ELSD（蒸发光散射器检测器）
文献报道同时测定青蒿中青蒿素、青蒿乙 素、青蒿酸的方法有HPLC-UV-ECD法（高 效液相色谱紫外电化学检测法）、HPLCMS/MS法,采用ELSD法（蒸发光散射检测 法）检测仅有很弱紫外吸收的青蒿素、UV 法检测青蒿中含量较低的青蒿乙素和青蒿 酸。
朗伯比尔定律：A=-lgT=εbc
b，ε一定，吸光度A和溶液浓度c成正比
∴青蒿素含量=( 青蒿素样品浓度×标准浓度单位×原始 体积) / 青蒿研细粉末质量
UV法总结
UV法测定青蒿素是依据青蒿素在碱性条件下生成的青蒿 素衍生物 Q292在292 nm波长处有较强的紫外吸收来定量 的，其优点是操作简单，对仪器设备的要求不高，其缺点 是不能排除青蒿素类似物等物质的干扰。因此，UV法测 定青蒿中青蒿素的含量实际反映的是药材中青蒿素及其类 似物的总量。陈靖等[5]报道，青蒿中青蒿素类似物青蒿 酸、青蒿素B、3α-羟基-1-去氧青蒿素的平均含量分别为 0.47％ 、0.05％、0.005％，对青蒿中青蒿素含量的测定 影响较大，使得测定结果偏高。
青蒿素的有效成分
青蒿素是从黄花蒿中提取 分离得到的含过氧基团的 新型半萜内酯。其多种衍 生物均是治疗疟疾的有效 单体，国内外公认的首创 新药。将青蒿素结构中的 C-10为羰基还原成羟基得 双氢青蒿素，进一步烷基 氧化得蒿甲醚，而进行酯 化可得到青蒿琥酯。
青蒿素 artemisinin
双氢青蒿素
双氢青蒿素为天然抗疟药
IR、MS、NMR HPLC
(UV、ELSD、SPD...) UPLC
LC-MS/LC-MS-MS 高效毛细管电泳 CE