实验目的
▪ 掌握鉴别大肠菌群的方法。
▪ 掌握以最大概率数法测定大肠菌群数 量的方法。
实验原理
大肠菌群指一群能发酵乳糖、产酸产气、 需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。 该菌主要来源于人畜粪便，以此作为粪便污 染指标来评价食品的卫生质量，推断食品有 否被肠道致病菌污染。
食品中大肠菌群以100ml 检样内大肠菌群 最可能数（MPN）表示。
实验设备
• 恒温培养箱：（36±1）℃ • 显微镜 • 培养皿 • 试管、移液管、三角烧瓶、小倒管 • 天平 • 载玻片
实验试剂
▪ 乳糖胆盐发酵管：
20g蛋白胨、5g 猪胆盐及10g乳糖溶于1L水中， 校正pH为7 .4，加25ml溴甲酚紫指示液(0.4 g/L)， 分装每管20 ml, 并放入一个小倒管，115℃高压 灭菌20 min。
▪ 乳糖发酵管：
将20 g蛋白陈和10g乳糖溶于1L水中，校正 pH至7.4，加入25mL溴甲酚紫指示液(0.4g/L)，按 检验要求分装，并放人一个小倒管，加热至 115℃高压灭菌15 min
▪ 灭菌生理盐水：0.9％
▪ 革兰氏染色液：
①结晶紫染色液： 1g结晶紫溶于20mL95%乙醇，与80mL草酸
大肠杆菌革兰氏染色照片
精品课件！
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思考题
1．大肠菌群的检验分哪几个步骤？各有何 作用？
2．在糖发酵试验中，若发现发酵倒管内存 在极微小的气泡，这种情况可否算作产 气阳性？
3．造成本实验误差的主要原因有哪些？
铵溶液（10g/ L)混合，摇匀。
②革兰氏碘液： 1g碘与2g碘化钾混合后，用少量水溶解，稀
释至300 mL。
③沙黄复染液： 0.25g沙黄溶于10ml95%乙醇中，然后用90ml
水稀释，混匀。
实验内容与步骤
1）检样稀释（无菌操作）
①将25mL（或g）检样置于含225mL灭菌生理盐水的 灭菌玻璃瓶，充分振摇（固体检样用匀浆器，用 8000－10000r/min的速度处理1 min）制成1：10的均 匀稀释液。
▪ 伊红美蓝琼脂平板：
10g蛋白陈、2gK2HPO4及17g琼脂溶解于1L水 中，校正pH至7.1，分装于锥形瓶内，121℃高压 灭菌15min。临用时加人10g乳糖并加热溶化琼脂， 冷 至 5 0 ～ 5 5 ℃ 。 加 人 2 0 mL 伊 红 溶 液 （ 2 0 g/L) 和 10ML美蓝溶液（6.5g/L）摇匀，倾注平板。
实验报告
根据证实为ห้องสมุดไป่ตู้肠菌群阳性的管数，查 MPN检索表，报告每100mL（或g）大肠 菌群的MPN。
注：
①本表采用3个稀释度：1ML(g)，0.1mL(g）和 0.01 mL (g)。每稀释度3管。
②表内所列检样量如改用10mL(g)，1mL(g）和 0.1mL(g）时，表内数字应相应降低10倍；如改 用0.1ML(g), 0.01ML(g）和0.001mL(g）时，则 表内数字应相应增加10倍，其余可类推。
附1：平板划线接种方法
1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法
附2：革兰氏染色法操作步骤
1、涂片：取大肠杆菌制成涂片，干燥，固定。 2、染色：用草酸铵结晶紫染色1min ,用水冲洗。 3、媒染：滴加革兰氏碘液冲去残水，并用碘液覆
盖1min，用水冲去碘液。 4、乙醇脱色：斜置载玻片于一烧杯上，滴加95%乙
3）分离培养
将产气的发酵管分别转接在伊红美蓝 琼脂平板上，置（36士1)℃恒温箱内培养18 一24 h。取出，观察菌落形态，并做革兰 氏染色和证实试验。
4）证实试验
在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落 1一2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵 管，置（36士1)℃恒温箱内培养（24士2) h， 观察产气情况。凡乳糖产酸产气、革兰氏 染色为阴性的无芽袍杆菌，即可报告为大 肠菌群阳性。
醇，并轻轻摇动载片，至乙醇液不呈现紫色时停 止（约0.5min）。立即用水冲净乙醇并用滤纸轻 轻吸干。脱色是革兰氏染色的关键，必须严格掌 握乙醇的脱色程度。若脱色过度则阳性菌被误染 为阴性菌；而脱色不够时阴性菌被误染为阳性菌。
5、复染：蕃红染液复染1min ,水洗。
6、吸干并镜检：若研究工作中要确证未知 菌的革兰氏反应时，则需同时用已知菌进 行染色作对照。
②用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，注入含有 9mL灭菌生理盐水的试管内，混匀，制成1 ：100的 稀释液。
③另取1mL灭菌试管，按②操作依次做10倍递增稀释 液，每稀释一次，换用一支1 mL灭菌试管。
2）乳糖发酵实验
接种2mL待检样品于乳糖胆盐发酵管内。 接种3个稀释度，每一稀释度接种3管，置 （36土1)℃温箱内培养（24士2) h。如所有乳 糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠杆 菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。
革兰氏染色法（Gram Stain）
步骤：
涂片固定
结果:
阳性菌——紫色 阴性菌——红色
结晶紫初染
碘液媒染
乙醇脱色
蕃红复染
细菌经结晶紫初染染成紫色。 革兰氏染色阳性菌（G+）细胞壁肽聚糖层数多， 为空间网状结构，再经乙醇脱水，网状结构更为致 密，染料复合物不易从细胞内漏出，仍为紫色。 革兰氏染色阴性菌（G-）细胞壁脂类含量多， 肽聚糖层数少，为平面片层结构，易被乙醇溶解， 使细胞壁通透性增高，结合的染料复合物容易泄漏， 细菌被脱色为无色，再经蕃红复染成红色。