干扰物质NaCl KCl Ca(NO 32葡萄糖麦芽糖果糖蔗糖酒石酸柠檬酸倍数200200200100100100100100100表 1 干扰物质的影响Table 1 Effect of foreign species 样品编号加入 (×10-5mol/L检出a (×10-5mol/L10.550.5420.760.7330.790.8240.970.98表 2 样品测定结果Table 2 Results of the determination of samples注:a 10次检测的平均值。
误差控制在±5%之内时。
因此,该电极应用于蔬菜和水果中抗坏血酸的测定将具有很好的选择性。
2.3.2样品测定为了验证该修饰电极能否在实际样品中抗坏血酸含量进行正确的测量,我们自制了几种样品。
自制样品组成为:1.0×10-4mol/L NaCl 、KCl 、Ca(NO 32、葡萄糖、麦芽糖、果糖、蔗糖、酒石酸及柠檬酸及0.5×10-5~1×10-5mol/L 抗坏血酸。
其测定结果如表2所示。
由表2可知,测定的抗坏血酸含量与已知含量基本一致。
3结论该新型的修饰电极具有极高的化学稳定性,且对溶液中的抗坏血酸具有良好的电催化作用,已成功地应用于水果中抗坏血酸含量的测定,获得了比较满意的结果,可望成为能满足不同需要的抗坏血酸传感器。
参考文献:[1] D W Martin Jr. Harper's Review of Biochemistry, 19th ed Eds: D W Martin Jr, PA Mayes, V W Rodwell. Lange, Los Altos, CA, 1983. 112.[2]胡慰望, 谢笔钧. 食品化学[M]. 北京: 科学出版社, 1992. 243.[3]黄伟坤, 等. 食品检验与分析[M]. 北京: 中国轻工业出版社, 1989.96.[4]A H Ensminger, M E Ensminger, J E Konlande, 等. 食品与营养百科全书[M]. 王淮洲, 王惟球, 王模善, 等译. 北京:农业出版社, 1989.收稿日期:2006-07-26 *通讯作者基金项目:四川省中医药管理局重点及专项项目(2003A001、2003C001作者简介:颜军(1971-,男,实验师,研究方向为生物活性成分的提取及检测。
TLC 快速分析多糖的单糖组成颜军,郭晓强,李晓光,邬晓勇,苟小军*(成都大学中药化学实验室,四川成都610106摘要:本文采用薄层色谱法分析多糖的单糖组成。
从斑点分离度、清晰度、有无拖尾现象及展层时间等方面综合评价展层效果。
通过实验确定了适合的展开剂为展开系统(乙酸乙脂:吡啶:无水乙醇:水=8:1:1:2、合适的显色剂为苯胺-二苯胺磷酸显色剂。
通过此体系确定了单糖的Rf 值,可用于快速分析水解多糖的单糖组分。
关键词:多糖;单糖组成;薄层色谱TLC to Fleetly Analyze Monosaccharide Composition of PolysaccharideYAN Jun ,GUO Xiao-qiang ,LI Xiao-guang ,WU Xiao-yong ,GOU Xiao-jun*(Laboratory of Traditional Chinese Medicine, Chengdu University, Chengdu 610106, ChinaAbstract :Applying TLC to analyze monosaccharide composition of polysaccharides was stuided. A mixed solution composed of ethylacetate, pyridine, alcohol and water in a ratio of V C 4H 8O 2:V C 5H 5N :V C 2H 6O :V H 2O = 8:1:1:2 by volume is used as extending system.A solution containing aniline and diphenylamine dissolved in acetone is used as coloration system. Satisfactory separation isacquired as shown by the thin layer chromatogram. Qualitative results can be obtained in accordance with the R f value of the standard spots. Distinct figures indicating the monosaccharide composition of polysaccharides obtained by the modified TLC.The extending system and coloration system can be used in monosaccharide composition analysis.Key words:polysaccharide;monosaccharide composition;thin-layer chromatography ( TLC中图分类号:TS207.3 文献标识码:A 文章编号:1002-6630(200612-0603-05多糖作为来自高等植物、动物细胞膜和微生物细胞壁中的天然高分子化合物,是构成生命的四大基本物质之一。
随着人们对多糖组成、性质、结构与功能研究的不断深入。
对多糖的生物活性也有了更多的认识,能提高机体免疫力,增强机体耐缺氧能力,清除自由基,抑制肿瘤,可用于治疗高血压、高血脂、糖尿病、乙型肝炎等多种现代医学中的疑难病症[1~3]。
多糖的研究受到了越来越广泛的重视。
并取得了丰硕的成果,已有香菇多糖、灵芝多糖等应用于临床。
国内外研究表明,多糖的活性与许多因素有关,如分子量、溶解性等,特别是与其空间结构密切相关[4,5]。
由于一级结构是空间结构的基础,而多糖的单糖组成是一级结构的主要内容,所以有必要找到一种简便、灵敏的方法以确定多糖的单糖组成。
单糖组分的分离测定方法目前主要有高效液相色谱法(HPLC、气相色谱法(GC、薄层色谱法(TLC等[6]。
采用G C测定糖类,遇到的主要困难是糖本身没有足够的挥发性,所以必须在气相色谱分析之前预先转化成易挥发、对热较稳定的衍生物。
另外,由于糖的异构化,在某些衍生物的制备过程中,会产生衍生物的异构体,使色谱分析时每种糖产生几个峰,这往往影响组分的分离和定量。
H P L C有分离速度快、分辨率高、分离效果好、重现性好、不破坏样品的优点。
但糖类本身没有紫外吸收,只能采用示差折光检测器(RI或蒸发光散射检测器(ELSD检测。
RI分辨率低而ELSD虽然效果好但目前价格昂贵。
另外,采用H P L C分析时,色谱柱的选择也比较困难。
一般采用氨基柱但分离效果欠佳,而专用的糖柱又十分昂贵。
为了找到一种常规实验室即可快速分析单糖组成的方法,我们摸索了薄层色谱法(T L C。
该方法是一种微量而快速的分析方法。
它兼备了柱层析和纸层析两者的优点并且操作方便,设备简单,容易掌握、便宜、灵活的特点。
本文采用T L C 对水解多糖的单糖组成进行分析,确定了适用于单糖分析的展开系统、显色系统及R f值。
1材料与方法1.1药品与材料银耳多糖本实验室自制;D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、L-鼠李糖、D-果糖上海试剂二厂;盐酸、乙酸乙脂、吡啶、无水乙醇、正丁醇、丙酮、正丁醇、异丙醇、醋酸、磷酸、硫酸、苯胺、二苯胺皆为分析纯试剂;实验用水为蒸馏水。
微量定量点样毛细管美国科尔帕默公司;20cm×20cm硅胶层析板德国默克公司。
1.2单糖和混合单糖标准溶液的配置分别称取果糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、鼠李糖,分别溶于蒸馏水中制得五种单糖标准液。
浓度均为1.00mg/ml。
分别称取葡萄糖、半乳糖、果糖、木糖、鼠李糖,共溶于2ml蒸馏水制得混合单糖标准液。
各单糖在混合单糖标准液中的浓度为0.50mg/ml。
1.3水解多糖样品的制备称取20mg多糖,溶解在5ml重蒸水中,加入12mol/L 的HCl 0.25ml,置于高压釜中在120~126℃条件下水解4h。
中和、透析后稀释至10m l。
1.4展开系统配置展开系统1:分别把乙酸乙脂、吡啶、无水乙醇、水按8:1:1:2(体积比的比例混合摇匀。
展开系统2:分别把正丁醇、丙酮、水按4:3:1(体积比的比例混合摇匀。
展开系统3:分别把正丁醇、乙酸乙脂、异丙醇、醋酸、水、吡啶按35:100:60:35:30:30(体积比的比例混合摇匀。
1.5显色剂的配置显色剂1(苯胺-二苯胺-磷酸显色剂:2%二苯胺丙酮溶液:2%苯胺丙酮溶液:85%磷酸按5:5:1的比例混合摇匀。
显色剂2:把10ml硫酸缓慢倒入90ml水中混合冷却,制得10%的硫酸溶液装瓶待用。
1.6操作步骤1.6.1点样将水解多糖、已知单糖标准液和混合单糖标准液,7种样品按一定顺序分别点样在薄层板上。
点样量约10μl,分次滴加,使点样扩散后其直径不超过2mm。
点样过程中用吹风机使样品干燥。
1.6.2展层将点好样品的薄层板置于密闭的层析缸中,用配置的展开剂,采用倾斜上行法,将薄层板的下端浸在展开剂中0.3~0.5cm ,至展开剂距离薄层板的上端约1cm 左右时取出自然风干。
1.6.3显色在除去溶剂后的薄层板上,均匀喷上显色剂,烘箱中加热显色。
2结果与分析2.1展开剂的比较2.1.1展开系统1用展开系统1按1.6对样品(1.混合单糖;2.果糖;3.半乳糖;4.葡萄糖;5.木糖;6.鼠李糖;7.水解多糖进行T L C 分析,展层效果见图1。
图1 展开系统1的展层效果图Fig.1 The result presented by using No.1 extending system1234567由图1可得,在展开系统1中混合单糖中各单糖完全分离,各单糖斑点集中无拖尾现象;水解多糖中呈现半乳糖、葡萄糖、果糖、木糖斑点。
由所得的T L C ,计算展开系统1中各单糖斑点的R f 值,结果见表1。
编号2果糖3半乳糖4葡萄糖5木糖6鼠李糖R f =0.398R f =0.305R f =0.374R f =0.563R f =0.7421混合单糖+++++7多糖++++表1 展开系统1中检出单糖组分表Table 1 The monosaccharide composition analyzed by usingNo.1 extending system注:“+”表示存在(下同。