第一章一、电泳电泳(eletrophorosis) :带电荷的分子在电场中以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动.移动速度称为电泳迁移率。

影响因素：1 电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比。

2. 电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。

3当电场强度一定,电泳介质相同,电荷相同的分子在电场中迁移的速度主要取决于分子本身的大小和形状(构型)。

4分子形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关: 分子量越大，移动越慢。

指示剂：溴酚蓝（Bb）：常用指示剂。

分子量670，分子筛效应小，近似于自由电泳，呈蓝紫色。

二甲苯青(Xc)：分子量554.6，呈蓝色，迁移速度比Bb慢。

染料：溴化乙锭（EB）1、聚丙烯酰胺凝胶电泳优点：比琼脂糖凝胶的分辨率高的多；回收DNA样品纯度高，无色透明，韧性好，银染的凝胶干燥后可长期保存；能装载的DNA量大，达每孔10μgDNA。

2 、SDS-PAGE 原理：SDS是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上相同密度负电荷。

SDS与蛋白质结合使蛋白质构象改变，成为形状近似雪茄状的长椭圆棒，SDS-蛋白质复合物短轴相同，而长轴与蛋白质的分子量成正比。

蛋白质-SDS复合物电泳的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒的长度，即蛋白质分子量有关。

二、PCR技术定义：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术，以DNA为模板，在引物、dNTPs、Taq酶的作用下，经变性－退货－延伸反复循环，使某个基因在体外特异性地扩增。

PCR法的原理也是利用人工合成带突变位点的诱变引物，通过PCR 扩增而获得定点突变的基因或DNA片段。

影响因素：（1）Taq DNA聚合酶（具有5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，但没有3’→5’外切酶活性因此不能修复错误的碱基配对）。

（2）引物（primer）一般引物设计为长15—30bp；位置与待扩增的模板DNA区段的两3’端序列互补（5‘端相同）的短DNA；引物的碱基组成：尽可能提高G+C含量，避免连续相同碱基排列或内部回文序列，避免形成引物二聚体。

（3）引物的Tm值：实际复性温度选择低于Tm值5 oC。

（4）dNTPs 含量适中（5）Mg 2+ 的浓度（6)对照实验三、PCR技术的扩展：反向PCR：不对称PCR：差异显示PCR。

反向PCR 原理：扩增两个引物外侧的未知序列，使引物的外侧序列“转变” 成内侧序列。

扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA，然后用连接酶连接成一个环状DNA分子，通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段。

不对称PCR：用于扩增单链DNA，单链DNA更适于测序。

mRNA差别显示技术：对组织特异性或诱导专一性表达基因进行分离的有效方法之一。

将mRNA逆转录和PCR技术相互结合发展起来的一种获得差异表达基因的RNA指纹图谱技术，也称为DDRT-PCR（差别显示RT-PCR）。

四、分子杂交分子杂交(简称杂交,molecular hybridization)其基本原理就是应用核酸分子的变性和复性的性质,使来源不同的DNA(或RNA)片段,按碱基互补关系形成杂交双链分子(heteroduplex)。

五、Blotting（印迹）：凝胶电泳分离的DNA或RNA在杂交之前通过毛细管虹吸作用或电导作用被转移到滤膜上，而且是按照其在凝胶中的位置原地“复印”上去，这一过程叫印迹。

六、常用的分子杂交类型（south与north的区别）1、Southern blotting：用DNA（RNA）探针检测DNA。

基本过程：样品DNA样品→酶切→电泳→碱变性→转膜→固定（80度或紫外线照射）→杂交→洗涤→放射自显影2、Northern blotting：用DNA（RNA）探针检测mRNA样品。

提取完整mRNA；进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，破坏RNA的局部双螺旋；其它步骤的原理与Southern印迹相似。

与Southern blotting相比，Northern blotting条件较严格，特别是RNA易降解，前期制备和转膜要防止Rnase的污染。

不需酶切。

3、原位杂交(Situ hybridization)：细胞及染色体上检测特异D N A或R N A序列的一种技术，是一种直接，简便的研究基因定位和表达的方法。

组织原位杂交（tissue in situ hybridization）和菌斑原位杂交4、蛋白质免疫印迹(Western-blotting)七、DNA序列分析1、Sanger双脱氧终止法*原理：双脱氧核苷酸，2’、3’都脱氧，3’无-OH，后续核苷酸不能连接，核苷酸链不能延伸。

最后得到一系列小片段，电泳。

（1）DNA复制是以一条链为模板，按碱基配对的原则进行的。

脱氧核糖的连接是以3’ 5’磷酸二脂键（2）复制反应可以在体外进行。

(3)反应体系中包括：单链模板、dNTPs、合适的引物、一定比例的2 ´, 3 ´ -双脱氧核苷三磷酸（ddNTP)以及若干种适量的无机离子。

（4）2’和3’双脱氧的ddNTP会使复制反应终止。

(5)凝胶电泳分离DNA单链片段时，小片段移动快，大片段移动慢。

2、Maxam-Gilbert化学修饰法(化学降解法)八、基因芯片（Gene Chip）在固体支持物上高度密度排列的DNA片段或寡核苷酸链，又称DNA 微阵列或寡核苷酸微阵列。

技术原理：一种大规模集成的固相杂交，指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或直接将大量预先制备的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面形成阵列，然后与标记的样品杂交。

通过杂交信号检测样品的遗传信息(基因序列及表达的信息)。

基因芯片的应用：①DNA测序②基因表达分析③基因诊断④基因突变：⑤药物研究与开发九、基因突变技术基因突变（gene mutation）:基因组DNA分子在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变，并引起个体表型的改变，而使生物体发生遗传变异。

特异性突变：寡核苷酸介导的基因突变；盒式突变；PCR点突变；基因合成。

1、寡核苷酸介导的基因突变（p38）原理使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段作为引物，启动单链M13噬菌体DNA进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成为新合成DNA子链的一个组成部分，新合成的子链便具有发生突变的碱基序列。

2、盒式诱导突变（cassette mutagene）----片段取代法（p39）以各种双链质粒DNA为载体，采用人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段置换待改造基因中两个不同限制酶切点之间的序列，在转化的大肠细菌中可形成数量众多的突变体。

这些合成的突变片段就好像不同的盒式录音磁带，可随时插入准备好的质粒中，称为盒式突变。

3、PCR点突变技术PCR法的原理也是利用人工合成带突变位点的诱变引物，通过PCR扩增而获得定点突变的基因或DNA片段。

第二章一、限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease）一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并在相关位置切割DNA双链的核酸内切酶。

限制性内切酶的类型：I 型、II 型、III型限制性内切酶。

II 型酶就是通常所说的DNA限制性核酸内切酶。

限制性内切酶的命名原则：基本名称：微生物的属名第一个字母大写斜体，种名的前两个字母小写斜体。

取变种或品系的第一个字母。

该微生物中发现的酶的顺序按照罗马字母顺序编写I、II、III等。

（填空题）同裂酶：异源同工酶:来源不同，但具有相同的识别序列的限制性内切酶。

同尾酶(Isocaudamer）来源不同，识别序列不同，但是切割DNA分子所得的DNA片段具有相同的粘性末端。

杂交位点（hybrid site）：同尾酶切割DNA产生的末端连接后所形成的新的位点。

同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。

识别位点在DNA分子中的频率计算：理论上有n个核苷酸的识别序列的酶出现概率为1/4n。

星号活力（Star activity）:在非标准条件下，切割一些与特异识别序列类似的序列，降低酶切反应的特异性，这种现象称为酶的星号活性记作: EcoRI*。

影响限制性内切酶活性的因素：1. DNA的纯度：①纯化DNA ②加大酶的用量1ugDNA用10U 酶③延长保温时间④扩大反应体积（>20 l）2. DNA的甲基化程度：基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株3. 温度不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。

大多数是37 oC，少数要求25-30oC或50-65 oC4. 缓冲液：商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。

二、连接酶基因克隆实验中常用的DNA连接方法：（P102）a、同聚物加尾连接用末端转移酶在载体和双链DNA的3'端各加一段寡聚核苷酸, 制成人工粘性末端b、衔接物连接法原理：（1）T4DNA连接酶连接linker与克隆DNA 片段。

（2）限制性内切酶消化具有衔接物的DNA分子和载体分子，产生出互补粘性末端，进行粘性末端的连接。

c、接头连接法原理：接头平末端与平末端的外源DNA片段连接之后，使后者成为具有粘性末端的新的DNA分子，而易于连接重组。

d、黏末端连接e、平末端连接连接酶连接作用发生在双链DNA上切口处的磷酸二酯键。

而不能连接两条单链DNA或双链DNA中缺失了核苷酸的缺口。

三、DNA聚合酶DNA聚合酶I的主要用途：切口平移(nick translation)法标记DNA（制备DNA探针）：原理:双链DNA在DNA酶I的作用下行成单链切口，DNA聚合酶I 利用5’→3’外切活性从切口的5’端逐步水解核苷酸时，酶的聚合活性则利用切口的3’游离羟基逐个加上相应的核苷酸，使得切口向下移动。

这种切口移动的现象称为切口平移。

如果反应中使用的单核苷酸底物是用同位素标记过的，则产物DNA分子既可作为带放射性的DNA分子杂交探针。

（利用DNA聚合酶I 的5’→3’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性。

）Klenow fragment(Klenow聚合酶)由DNA Pol I经枯草杆菌蛋白酶处理产生的。

性质:具有5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性。

T4 DNA聚合酶的性质：5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性（降解单链更快）。

逆转录酶：依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）。

作用：具有5’→3’聚合酶活性；具有RNaseH活性，双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链。

用途：构建cDNA文库四、DNA修饰酶1、S1核酸酶特点：高度单链特异性：降解单链DNA或RNA，降解DNA速度大于RNA速度；内切或外切；需pH4.0-4.3环境，Zn2+激活2、碱性磷酸酶：来自于小牛肠（CIP）或大肠杆菌（BAP），用于去掉DNA or RNA分子的5’端的磷酸基团。