绪论1.理论上的三大发现：（1）1944年，美国微生物学家Avery证明基因就是DNA分子，提出 DNA是遗传信息的载体。

（2）1953年，美国科学家Watson 和英国科学家Crick提出 DNA Double Helix model。

1958年，Meselson 和Stahl证明 DNA半保留复制。

（3）1968年，Nirenberg、Holley和Khorana解读了遗传密码及其在蛋白质合成方面的技能而分享诺贝尔生理医学奖。

2.技术上的三大发现:（1）限制性核酸内切酶的发现（1962年Arber ）（2）DNA连接酶的发现（1967Gellert）（3）基因工程载体的发现3.基因工程研究的内容：(1)从生物有机体复杂的基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。

(2)在体外，将带有目的基因的DNA片段连接到能够自我复制并具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子。

(3)将重组DNA分子引入到受体细胞(亦称宿主细胞或寄主细胞)。

(4)带有重组体的细胞扩增，获得大量的细胞繁殖群体(菌落)。

(5)从大量的细胞繁殖菌落中，筛选出具有重组DNA分子的细胞克隆。

(6)将选出的细胞克隆的目的基因进行进一步研究分析；(7)将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。

第二章基因克隆所需的工具酶一、限制性内切酶1．限制性核酸内切酶:是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。

它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。

限制作用：是指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA 对生物细胞的入侵受到限制修饰作用：生物细胞(如宿主)自身的DNA分子合成后，通过修饰酶的作用：在碱基中特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏。

2．核酸内切限制酶的类型：I型、II型、III型3．核酸内切限制酶的命名法由H．O．Smith和D．Nathans(1973)提议的命名系统4.Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性：a. 在DNA分子双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子产生链的断裂；b. 2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的；c.??? 因此，断裂的结果形成的DNA片段，也往往具有互补的单链延伸末端。

一、识别位点：绝大多数的II型核酸内切限制酶，都能够识别由4～8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。

我们称这样的序列为核酸内切限制酶的识别序列。

切割位点都具有相同的双重旋转对称的结构形式（回文结构）。

二、切割类型：（1）两条链上的断裂位置是交错地、但又是对称地围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片段；（2）两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片段。

三、产生的末端特征：1、粘性末端：是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。

（平末端的DNA片段则不易于重新环化。

）2、同裂酶：有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶序列，这类酶特称为同裂酶。

3、同尾酶：与同裂酶对应的一类限制性内切酶,它们虽然来源不同，识别的靶序列也各不相同,但都能产生相同的粘性末端,特称为同尾酶。

4、由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点，特称之为“杂种位点”。

四．影响核酸内切限制酶活性的因素：(1) DNA的纯度。

提高核酸内切酶对低纯度DNA的反应效率，一般采用如下三种方法：①增加核酸内切限制酶的用量，平均每微克底物DNA可高达10单位甚至更多些。

②扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑制因素被相应地稀释。

③延长酶催化反应的保温时间。

(2) DNA的甲基化程度：核酸内切限制酶是原核生物限制—修饰体系的组成部分，因此识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，便会强烈地影响酶的活性。

为避免产生这样的问题，在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒DNA。

(3) 酶切消化反应的温度：大多数核酸内切限制酶的标准反应温度都是37℃。

消化反应的温度低于或高于最适温度，都会影响核酸内切限制酶的活性，甚至最终导致完全失活。

(4) DNA的分子结构(5) 核酸内切限制酶的缓冲液：核酸内切酶的标准缓冲液的组份包括：氯化镁、氯化纳或氯化钾、Tris-HCl,?-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白（BSA）等。

酶活性的正常发挥，是绝对地需要二价的阳离子，通常是Mg2+。

pH=7．4时，最佳1、星号活性：EcoRI限制酶的这种特殊的识别能力，通常叫做星号活性，以EcoRI*表示。

二．DNA连接酶1、种类：①、T4噬菌体DNA连接酶：可连接 1，两个带有互补粘性末端的双链DNA分子2，两个带有平末端的DNA双链DNA分子3，一条链带有切口的DNA分子4，RNA：DNA杂合体中RNA链上的切口，也可将RNA末端与DNA链连，底物广泛。

②、大肠杆菌DNA连接酶1.底物是一条链带有切口的双链DNA分子2.具有同源互补粘性末端的不同DNA片段3.几乎不能催化两个平末端的不同DNA片段4.底物要求严格，假阳性背景底4、携带特殊的遗传标记6、受体细胞应具备的条件：限制性缺陷型、重组整合缺陷型、具有较高的转化效率、具有与载体选择标记互补的表型、感染寄生缺陷型三、DNA聚合酶1、DNA聚合酶I是一个多功能酶，它包括三种不同的酶活力：(1) 5’---->3，聚合酶活性：催化单核苷酸结合到DNA模板的3，一OH末端，以ssDNA作模板，沿引物的3，一OH方向按模板顺序从5，一3’延伸。

(2) 5， ----> 3，外切酶活性：E．co1i DNA 聚合酶1也能从游离的5，末端降解dsDNA成为单核苷酸。

(3) 3，----> 5，外切酶活性：DNA聚合酶I还能从游离的3，OH末端降解dsDNA或ssDNA成为单核苷酸。

缺口转移：指在DNA分子的单链缺口上，DNA聚合酶I的5’--->3，核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生。

当外切酶活性从缺口的5，一侧移去一个核苷酸之后，聚合作用就会在缺口的3，一侧补上一个新的核苷酸。

但由于PolI不能够在3，—OH和5，—P之间形成一个键，因此随着反应的进行，5，一侧的核苷酸不断地被移去，3，一侧的核苷酸又按序地增补，于是缺口便沿着DNA分子按合成的方向移动。

这种移动特称为缺口转移。

2 ．Klenow片段Klenow聚合酶的主要用途：标记DNA末端。

１）修补经限制酶消化的DNA所形成的3隐蔽末端；２）标记DNA片段的末端；3. T4DNA聚合酶T4DNA聚合酶，是从T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出来的一种特殊的DNA聚合酶。

具有两种酶催活性，即5，--->3，的聚合酶活性和3，--->5，的核酸外切酶活性。

4.TaqDNA 聚合酶从极度嗜热菌提出。

具有5’ 3’聚合酶活性和3’ 5’外切酶活性。

主要用于PCR扩增。

四、逆转录酶1、又称RNA依赖的DNA聚合酶。

这是一种有效的转录RNA成为DNA的酶。

产物DNA又称cDNA2、逆转录酶的主要用途是转录mRNA成为cDNA制备基因片段。

另外，它也可用ssDNA或RNA做模板制作制备，杂交探针。

3、逆转录酶的酶活性：(1) RNA依赖的DNA聚合酶以RNA链为模板，以带3，一OH末端的DNA片段为引物，沿5，--->3，方向合成DNA 链。

(2) DNA依赖的DNA聚合酶以ssDNA为模板，以带有3’一OH末端的DNA片段为引物，从5’--->3’方向合成DNA链。

(3)外切RNA酶活性底物是RNA—DNA杂交分子中的RNA链，有两种活性形式。

从RNA链5’末端外切的称5’--->3’外切RNA酶，从RNA链3’末端外切的称3，--->5，外切RNA酶H。

第三章基因克隆载体1、载体：指携带外源基因进入受体细胞的这种工具。

（载体的本质是DNA）2、基因工程中所用的载体：(1)?? 质粒(Plasmid)，主要指人工构建的质粒。

(2)噬菌体且的衍生物。

(3)cosmid(柯斯质粒)。

(4)单链DNA噬菌体M13。

（5）动物病毒。

3、作为基因工程用的载体，以下三方面是它们共有的特性和基本要求：(1)在宿主细胞中能独立自主的复制，即本身是复制子。

(2)容易从宿主细胞中分离纯化。

(3)载体DNA分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域，插在其中的外源基因可以象载体的正常组分一样进行复制和扩增。

一、质粒载体1、质粒：是染色体以外能自主复制的双链闭合环状DNA分子，它广泛存在于细菌细胞中。

在霉菌、蓝藻、酵母和不少动植物细胞中也发现有质粒存在。

2、F质粒：又叫F因子或性质粒(sex plasmid)。

F因子是雄性决定因子，所以F+细胞又叫雄性细胞，与此相应的F—细胞则叫做雌性细胞。

3、R质粒：也称抗药性因子。

R质粒编码一种或数种抗菌素抗性基因，此种抗性通常能转移到缺乏该质粒的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力4、Col质粒：此类质粒编码有控制大肠杆菌素合成的基因，即所谓产生大肠杆菌素因子。

大肠杆菌素是一种毒性蛋白，它可以使不带Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死。

5、在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同一宿主细胞中稳定地共存，这一现象称为质粒的不亲和性，也称不相容性。

6、质粒载体的基本条件(1) 能自主复制，即本身是复制子(2) 具有一种或多种限制酶的单一切割位点，并在此位点中插入外源基因片段，不影响本身的复制功能；(3) 在基因组中有1—2个筛选标记，为寄主细胞提供易于检测的表型特征。

(4) 分子量要小，多拷贝，易于操作。

7、载体的功能：运送外源基因高效转入受体细胞、为外源基因提供复制能力或整合能力、为外源基因的扩增或表达提供必要的条件8、载体应具备的条件（共有特性）：(1) 在宿主细胞中能独立和稳定的自我复制，即本身是复制子。

(2) 具有合适的限制性内切酶位点。

(3) 具有合适的选择标记基因，来筛选重组体DNA9、质粒：是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。

（质粒常见于原核细菌和真菌中，绝大多数的质粒是DNA型的）绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制，10、根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为：严紧型松弛型复制控制的质粒、松弛型复制控制的质粒11、质粒的基本特性：1、质粒的自主复制性2、质粒的不相容性3、质粒的可转移性12、革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒（能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞《结合作用》）、非接合型质粒（不能在天然条件下独立地发生接合作用）13、实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA： 1、氯化铯密度梯度离心法 2、沸水浴法 3、碱溶法14、按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类：单链DNA病毒、双链DNA病毒、单链RNA病毒、双链RNA病毒15、考斯质粒：是一类人工构建的含有l-DNA cos序列和质粒复制子的特殊类型的载体。